發(fā)布時(shí)間：2020-06-10 18:02

【摘要】：研究目的:視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)自身反應(yīng)性炎性脫髓鞘疾病,主要累及脊髓和視神經(jīng),還可累及腦實(shí)質(zhì)。研究表明NMO的主要病理特征為水通道蛋白-4(Aquaporin 4,AQP4)自身抗體(AQP4-immunoglobulin G,AQP4-IgG)結(jié)合星形膠質(zhì)細(xì)胞表面的AQP4后,激活補(bǔ)體,導(dǎo)致一系列炎癥反應(yīng),造成星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損和神經(jīng)元死亡。目前NMO的治療方式主要是免疫調(diào)節(jié)及血漿置換,但患者仍有較高的死亡率或嚴(yán)重的后遺癥。單克隆抗體用于治療NMO正受到越來(lái)越多的關(guān)注,例如,利妥昔單抗(Rituximab)、依庫(kù)珠單抗(Eculizumab)和托珠單抗(Tocilizumab)等單克隆抗體藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,部分抗體藥物已經(jīng)展現(xiàn)出較好的臨床效果。但是,當(dāng)前開(kāi)展臨床試驗(yàn)的該類(lèi)藥物多數(shù)為鼠源的單克隆抗體,長(zhǎng)期應(yīng)用有引起患者的人抗鼠免疫原性反應(yīng)(Human anti-mouse anti-antibody,HAMA)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究的目的是通過(guò)體外噬菌體展示技術(shù)從全人源單鏈抗體庫(kù)中篩選出能夠特異性結(jié)合補(bǔ)體C5(Complement C5,C5)的單鏈抗體(Single-chain variable fragment,scFv),并明確其對(duì)NMO疾病模型的治療效果。研究方法:本研究利用噬菌體展示體外固相篩選技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)(6×10~(10))中篩選能夠特異性結(jié)合C5的單鏈抗體。經(jīng)過(guò)5輪的篩選(吸附-洗脫-擴(kuò)增),隨機(jī)挑選了239個(gè)噬菌體克隆,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)驗(yàn)證其與補(bǔ)體C5的結(jié)合能力和結(jié)合特異性。根據(jù)ELISA多次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇在A450 nm數(shù)值較高的部分克隆進(jìn)行核酸序列測(cè)定,使用DNAMAN進(jìn)行序列多樣性分析和序列比對(duì),確定重復(fù)序列較高的陽(yáng)性克隆。將重復(fù)序列最高的3個(gè)基因插入到原核表達(dá)載體pET30a(帶有his標(biāo)簽)中。在低溫(16°C)條件下培養(yǎng),使用異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)誘導(dǎo)單鏈抗體基因在大腸桿菌BL21中可溶性表達(dá)。離心收集菌體后進(jìn)行蛋白純化,經(jīng)過(guò)親和層析、DEAE層析、Butyl層析一系列的純化得到純度在90%以上的可溶性單鏈抗體;用超濾管濃縮蛋白濃度至40 mg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);通過(guò)SDS-PAGE變性膠觀察蛋白的片段大小,應(yīng)用Western Blot、ELISA法鑒定可溶性單鏈抗體與補(bǔ)體C5結(jié)合的特異性;進(jìn)一步用Biacore T200進(jìn)行單鏈抗體與C5結(jié)合的親和力和濃度依賴(lài)情況的檢測(cè),從而確定單鏈抗體的親和力與補(bǔ)體C5的結(jié)合情況。挑選特異性較好的單鏈抗體作用于NMO體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵悦鞔_目標(biāo)單鏈抗體對(duì)NMO的治療效果:利用AQP4-IgG和人補(bǔ)體(human complement,hC)作用于穩(wěn)定表達(dá)AQP4的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamsters ovary,CHO)模擬NMO的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過(guò)LIVE/DEAD染色的方法驗(yàn)證篩選得到的單鏈抗體對(duì)NMO細(xì)胞模型細(xì)胞毒性的影響;選擇腦實(shí)質(zhì)注射N(xiāo)MOSD血清陽(yáng)性患者的抗體(IgG_(NMOSD))和人補(bǔ)體在體內(nèi)模擬視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病情況,通過(guò)相關(guān)組織染色確定病灶及炎癥細(xì)胞的變化,并進(jìn)一步明確篩選得到的單鏈抗體對(duì)NMO的保護(hù)效果。結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)5輪噬菌體篩選得到了8個(gè)抗體序列(C5B3、C5B35、C5B98、C5B106、C5A6、C5A102、C5A121、C5A152)。將同源性最高的3個(gè)序列原核表達(dá)后進(jìn)行一系列純化,獲得了純度在90%以上的可溶性單鏈抗體。2.對(duì)純化后的可溶性單鏈抗體(C5B3、C5A6、C5B35)進(jìn)行了體外功能驗(yàn)證。結(jié)果表明,C5B3明顯減少了穩(wěn)定表達(dá)AQP4的CHO細(xì)胞的補(bǔ)體依賴(lài)性的細(xì)胞毒性作用,明顯減少了膜攻擊復(fù)合物的形成及死亡細(xì)胞的數(shù)量,且該作用具有明顯的C5B3濃度依賴(lài)性。3.對(duì)單鏈抗體C5B3進(jìn)行了體內(nèi)功能驗(yàn)證。在NMO動(dòng)物模型中,C5B3明顯減小了腦實(shí)質(zhì)注射IgG_(NMOSD)和人補(bǔ)體引起的病灶體積和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),并且能夠減少體內(nèi)膜攻擊復(fù)合物的形成。結(jié)論:通過(guò)對(duì)全人源性噬菌體抗體庫(kù)的篩選獲得了特異性結(jié)合補(bǔ)體C5的單鏈抗體,經(jīng)過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)得到的1個(gè)單鏈抗體(C5B3)能夠減少AQP4-IgG和人補(bǔ)體造成的細(xì)胞毒性,對(duì)NMO動(dòng)物模型也能發(fā)揮一定的保護(hù)作用。
【圖文】：

32圖 1.經(jīng)過(guò)五輪的噬菌體篩選得到能與補(bǔ)體 C5 結(jié)合的噬菌體抗體。將用 0.1 M pH9.6 碳酸鈉碳酸氫鈉溶液稀釋補(bǔ)體 C5（母液為 1mg/mL）后包被 ELISA 孔板，每輪包被的抗原量為 800 ng、600 ng、500 ng、 400 ng、300 ng，包被體系每孔 50～100μl，4°C 過(guò)夜；隨著篩選輪數(shù)的增加，包被抗原的量逐漸較少，通過(guò) ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的五輪的噬菌體抗體庫(kù)與目的蛋白補(bǔ)體 C5 的結(jié)合情況，在篩選進(jìn)行至第五輪時(shí)，挑選部分噬菌體克隆檢測(cè)與補(bǔ)體C5 的結(jié)合情況。（A）隨著篩選的進(jìn)行 PCR 結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆逐漸增多；（B）ELISA 結(jié)果顯示隨著篩選的進(jìn)行噬菌體抗體庫(kù)與補(bǔ)體 C5 的在 A450 nm 的數(shù)值逐漸增加，結(jié)合力逐漸增強(qiáng)，在篩選進(jìn)行至第 4 輪和第 5 輪時(shí)變化相對(duì)平緩；（C）在第 5 輪時(shí)，挑選 239 個(gè)單個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行 ELISA 實(shí)驗(yàn)，不同的噬菌體克隆與補(bǔ)體 C5 結(jié)合是不同的。2.2 構(gòu)建同源性較高的抗體序列至原核表達(dá)載體通過(guò)噬菌體抗體 ELISA 和測(cè)序得到 8 個(gè)單鏈抗體，，根據(jù) ELISA 鑒定結(jié)果選

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文擇親和能力較強(qiáng)和同源序列較高 C5B3、C5A6 和 B5B35 進(jìn)行可溶性單鏈抗體的原核表達(dá)。將 C5B3 單鏈抗體基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體 pET28a、PGEX-4T、pET30a 內(nèi)，挑取單個(gè)克隆做菌落 PCR，單鏈抗體的核酸序列約 750 bp，陽(yáng)性率為 100%，結(jié)果如圖 2A，初步判斷 C5B3 基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體內(nèi)，為進(jìn)一步確認(rèn)載體構(gòu)建成功挑選部分陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，序列分析主要是通過(guò) DNAMAN 比對(duì)測(cè)序所得的片段和 C5B3 基因片段是否完全一致，和C5B3 目的基因插入的位置是否正確；以 pET-30a 為例進(jìn)行說(shuō)明，圖 2B 為pET30a-C5B3 構(gòu)建載體的模式圖。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R744.52

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本文編號(hào)：2706650