發(fā)布時間：2024-07-08 23:04

　　目的:糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的重大慢性疾病之一。根據(jù)最新報道,我國成年人糖尿病的患病率為10.9%,是世界上糖尿病病人最多的國家。在所有糖尿病病人中,2型糖尿病約占90-95%。盡管在過去的20年中,國內(nèi)外學(xué)者對2型糖尿病進(jìn)行了大量的研究工作,但其具體的病理生理機制仍不十分清楚。目前認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展因素可分為以下三類:(1)遺傳易感因素;(2)胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)所致的細(xì)胞毒性;(3)與生活和飲食方式相關(guān)的風(fēng)險因素等。2型糖尿病病人以胰島β細(xì)胞功能障礙和數(shù)量顯著減少、胰島素抵抗及胰島淀粉樣蛋白沉積形成為主要病理生理學(xué)特征。其中,人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)是胰島淀粉樣蛋白沉積的主要成分。越來越多的研究表明,hIAPP誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡增加在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。因此,預(yù)防和減少hIAPP沉積可減少胰島β細(xì)胞凋亡、改善胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能。自噬-溶酶體系統(tǒng)是細(xì)胞降解錯誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器的主要途徑之一。目前研究認(rèn)為自噬-溶酶體系...

【文章頁數(shù)】：113 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細(xì)胞自噬流的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 材料與試劑
            2.1.1 細(xì)胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準(zhǔn)備
            2.2.3 Western Blot檢測TAT-FLPNF、FLPNF對 INS-1 細(xì)胞LC3 表達(dá)的影響
            2.2.4 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 INS-1 細(xì)胞活力的影響
            2.2.4 過表達(dá)hIAPP的 hIAPP-INS-1 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.6 Western Blot檢測不同濃度TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞LC3 表達(dá)的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對hIAPP-INS-1 細(xì)胞LC3、P62 表達(dá)的影響
            2.2.8 透射電子顯微鏡檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞自噬體數(shù)量的影響
            2.2.9 表達(dá)m RFP-GFP-LC3的hIAPP-INS-1 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.10 激光共聚焦顯微鏡檢測hIAPP-INS-1 細(xì)胞內(nèi)自噬流情況
            2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 短肽TAT-FLPNF可進(jìn)一步增加INS-1 細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值
        3.2 短肽TAT-FLPNF不影響INS-1 細(xì)胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF增加細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值的最佳濃度為200μM
        3.4 短肽TAT-FLPNF增加LC3-II/LC3-I比值可被自噬抑制劑3-MA阻斷
        3.5 短肽TAT-FLPNF顯著增加細(xì)胞自噬體數(shù)量
        3.6 短肽TAT-FLPNF促進(jìn)細(xì)胞自噬體的形成
        3.7 短肽TAT-FLPNF增強細(xì)胞自噬流
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :短肽FLPNF增強hIAPP-INS-1 細(xì)胞自噬流的分子機制研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細(xì)胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準(zhǔn)備
            2.2.3 過表達(dá)hIAPP的 hIAPP-INS-1 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.4 表達(dá)myr-Akt的 HEK-293-myr-Akt細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.5 過表達(dá)Flag-labeled mTOR的 HEK-293 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.6 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞p70S6K及 S6 磷酸化水平的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 HEK-293-myr-Akt細(xì)胞GSK3β及S6磷酸化水平的影響
            2.2.8 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞Akt、p70S6K及S6磷酸化水平的影響
            2.2.9 流式細(xì)胞儀檢測Anti-Flag免疫磁珠上的FITC信號強度
            2.2.10 Autodock Vina軟件預(yù)測短肽FLPNF與 FRB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合情況
            2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 短肽TAT-FLPNF抑制PI3K-Akt-mTOR-p70S6K信號通路
        3.2 短肽TAT-FLPNF抑制mTOR活性
        3.3 短肽TAT-FLPNF抑制mTORC1 活性,但不影響mTORC2 活性
        3.4 短肽FLPNF與 FRB結(jié)構(gòu)域結(jié)合
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分 :短肽FLPNF減少hIAPP寡聚體沉積、保護(hù)hIAPP-INS-1 細(xì)胞的實驗研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1
            2.1.1 細(xì)胞
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.2 短肽的合成與準(zhǔn)備
            2.2.3 過表達(dá)hIAPP的 hIAPP-INS-1 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.4 過表達(dá)r IAPP的 r IAPP-INS-1 細(xì)胞的構(gòu)建
            2.2.5 寡聚體抗體A11 檢測短肽TAT-FLPNF對 hIAPP寡聚體沉積的影響
            2.2.6 CCK-8 檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞活力的影響
            2.2.7 Western Blot檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1細(xì)胞CleavedCaspase-3 表達(dá)的影響
            2.2.8 ELISA檢測TAT-FLPNF對 hIAPP-INS-1 細(xì)胞GSIS功能的影響
            2.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析
    3 結(jié)果
        3.1 短肽TAT-FLPNF減少hIAPP-INS-1 細(xì)胞內(nèi)hIAPP寡聚體沉積
        3.2 短肽TAT-FLPNF提高h(yuǎn)IAPP-INS-1 細(xì)胞活力
        3.3 短肽TAT-FLPNF降低hIAPP-INS-1 細(xì)胞Cleaved Caspase-3 水平
        3.4 短肽TAT-FLPNF改善hIAPP-INS-1 細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素分泌能力
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：4004010