發(fā)布時間：2020-04-17 06:12

【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)又被稱為河蝦,是我國重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種之一,其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,頗受消費者的青睞。但是日本沼蝦能夠引起嚴重的過敏反應(yīng),對過敏患者的生活造成極大的困擾。日本沼蝦的消費量在逐年增長,但是相較于其他甲殼類,有關(guān)日本沼蝦過敏的研究卻較少。因此,本研究旨在科學評價日本沼蝦致敏性,為進一步深入認知日本沼蝦過敏提供依據(jù)。本文以日本沼蝦原肌球蛋白為研究對象,對其致敏性進行體外和動物實驗評價。研究內(nèi)容主要包括:日本沼蝦原肌球蛋白的分離鑒定;日本沼蝦原肌球蛋白免疫應(yīng)答的研究;基于KU812細胞模型及動物模型評價日本沼蝦原肌球蛋白的致敏性。本研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下:1.采用硫酸銨鹽析以及陰離子交換層析法分離純化日本沼蝦原肌球蛋白,并利用SDS-PAGE和質(zhì)譜技術(shù)進行分析鑒定。結(jié)果表明,該方法純化得到的原肌球蛋白純度可達90%以上。該方法簡單可靠,且提純效果較好,適用于實驗室少量制備。2.以純化的日本沼蝦原肌球蛋白為抗原,免疫新西蘭大白兔,獲得抗日本沼蝦原肌球蛋白的兔多克隆抗體,并通過間接ELISA法和免疫印跡法檢測其效價和特異性。結(jié)果顯示,制備的兔抗日本沼蝦多克隆抗體效價最高可達1:1,638,400,且特異性較強。由此提示,制備的原肌球蛋白具有良好的抗原性。3.利用蝦類過敏患者血清與KU812細胞共同孵育,通過檢測KU812細胞活化脫顆粒釋放的組胺、β-氨基己糖苷酶、鈣離子、IL-4、IL-6及TNF-α的含量評價日本沼蝦原肌球蛋白的致敏性。研究結(jié)果顯示,原肌球蛋白組細胞胞內(nèi)鈣離子表達量為79.8%,比空白組鈣離子表達量高79.6%,比粗蛋白組高11.4%;原肌球蛋白組細胞β-氨基己糖苷酶釋放率為56.88%,與其他兩組相比顯著升高;原肌球蛋白組細胞上清液中組胺、IL-4、IL-6、TNF-α的含量分別為15.47μg/mL、3.36 ng/mL、793.33 pg/mL、411.53 pg/mL,都顯著高于空白對照組和粗蛋白組。由此可見,日本沼蝦原肌球蛋白對KU812細胞具有明顯的脫顆粒作用和致敏性。4.通過建立Balb/c小鼠致敏模型對日本沼蝦原肌球蛋白的致敏性進行評估。結(jié)果顯示,原肌球蛋白組小鼠產(chǎn)生了明顯的過敏癥狀,且該組小鼠血清中的特異性IgE和IgG1水平均顯著高于其他組;原肌球蛋白組小鼠血漿中組胺含量為28.11μg/mL,同樣顯著高于其他組含量;原肌球蛋白組小鼠血清中的mMCP-1及脾細胞釋放的IL-4、IL-5、IL-13、IL-21、IFN-γ水平分別為:470.17 ng/mL、24.26 pg/mL、186.40 pg/mL、597.90 pg/mL、1.46 pg/mL、1863.00 pg/mL,其中mMCP-1、IL-4、IL-5、IL-13的水平均明顯高于PBS和CT組,IFN-γ水平則明顯低于其他組。綜合上述各項指標的檢測結(jié)果可知,原肌球蛋白具有很強的致敏性。
【圖文】：

用 SPSS 22.0 軟件進行單示具有極顯著性差異，作定粗蛋白成分本沼蝦肌肉中的粗蛋白以示。日本沼蝦粗蛋白成分分子質(zhì)量最大的可超過 1 以上，其中相對分子質(zhì)量約后，大量的雜蛋白被除去

A B圖 2.2 硫酸銨分段鹽析 SDS-PAGE 電泳圖A：20%-50%硫酸銨鹽析上清中蛋白質(zhì)成分。M：Marker；1：20%上清；2：30%上清；3：40%上清；4：50%上清
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R593.1;S917.4

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本文編號：2630556