發(fā)布時(shí)間：2020-04-12 06:58

【摘要】：目的觀察虎杖苷(Polydatin,PD)對(duì)百草枯(Paraquat,PQ)中毒大鼠肺濕干比(Wet-to-dry weight ratio,W/D)改變,血漿和各組織PQ濃度、肺組織及血清脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(Lipid peroxidation,LPO)和炎癥細(xì)胞因子水平的影響,探索其對(duì)急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)的保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用PD治療PQ中毒ALI提供理論基礎(chǔ)。方法(1)實(shí)驗(yàn)一:建立適合本研究的急性百草枯中毒大鼠模型。取健康雌性SD大鼠32只,體重約(200±20)g,按正常生活條件適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后,禁食不禁水12h,同時(shí)觀察大鼠無(wú)異常情況后稱(chēng)體重,并按數(shù)字隨機(jī)分組法分成4組,正常對(duì)照組、各劑量染毒組(每組8只);正常對(duì)照組生理鹽水1ml/kg灌胃,各染毒組分別以20%PQ液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高(75mg/kg)三種劑量進(jìn)行一次性灌胃。染毒后予以普通正常喂養(yǎng)7天,期間不作任何處理。每天上午固定時(shí)間觀察各組大鼠的一般情況,包括有無(wú)精神反應(yīng)萎靡、口鼻唇四爪發(fā)紺、呼吸困難及病理呼吸音、進(jìn)食進(jìn)水排泄情況的異常、攻擊性活動(dòng)降低、毛色蓬松黯淡、出血及死亡或存活等綜合情況并詳細(xì)記錄,8天后將所有存活大鼠全部予以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉處死,解剖胸腔取肺組織,PBS緩沖液(pH值為7.3、0.1mol/L)反復(fù)沖冼,10%甲醛溶液固定,4℃冰箱保存待行肉眼大體病理學(xué)及病理HE染色觀察肺部情況,同時(shí)計(jì)算各染毒組大鼠的生存率,從而得出適合本研究染毒模型PQ的最佳劑量。(2)實(shí)驗(yàn)二:紫外分光光度法檢測(cè)血清中百草枯方法的建立選用清潔級(jí)健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,體重約(200±20)g,將所有大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=5)和染毒組(n=25)。采取一次性灌胃法構(gòu)建動(dòng)物模型:染毒組以20%百草枯水劑按25mg/kg;對(duì)照組給予等量1mL/kg生理鹽水;給藥后每組采樣時(shí)間(于6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組5只),以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉處死,分別解剖采集血清600μL與20%三氯乙酸100μL混勻以12000r/min離心10min取0.2ml的上清液,加1.8mL的蒸餾水進(jìn)行紫外分光光度法(ultravioletspectrophotom-etry,Uv)測(cè)定其中百草枯的含量。本實(shí)驗(yàn)采取低溫高速離心、20%三氯乙酸直接沉淀雜質(zhì)蛋白分離提取中毒大鼠血漿或組織中的PQ濃度,建立Uv定量方法。用所建立的Uv檢測(cè)方法,對(duì)PQ中毒大鼠的血漿、或肺、心、肝、腎進(jìn)行檢測(cè),以為下一步實(shí)驗(yàn)探討血漿或組織中的PQ濃度與中毒預(yù)后的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。(3)實(shí)驗(yàn)三:虎杖苷對(duì)急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療作用為評(píng)價(jià)PD對(duì)PQ致大鼠急性中毒的治療作用,選用健康雌性SD大鼠80只,體重約(200±20)g,隨機(jī)分為分為3組:正常對(duì)照組(n=20)、染毒組(n=30)和PD干預(yù)組(n=30)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,染毒組和PD干預(yù)組均以20%百草枯水劑按25mg/kg一次性灌胃,建立大鼠百草枯中毒模型。PD干預(yù)組大鼠在染毒后60min給予120mg/kg虎杖苷干預(yù)藥物灌胃,染毒組及正常對(duì)照組大鼠給予等量1ml/kg生理鹽水灌胃,之后每日1次,共連續(xù)給藥3天。分別于試驗(yàn)開(kāi)始后6h、12h、24h、48h、72h觀察每組大鼠中毒反應(yīng),并麻醉處死(每時(shí)間點(diǎn)染毒組和PD干預(yù)組6只,正常對(duì)照組4只),收集血清和各組織標(biāo)本-80℃冰箱保存待檢。生化法嚴(yán)格按各試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)含量;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、白介素-6(IL-6)的水平及變化規(guī)律;同時(shí)留取部分肺組織分別檢測(cè)核因子-κB(NF-κB)、羥脯氨酸(HYP)及濕/干重比值(W/D)觀察肺組織纖維化程度;紫外分光光度法(Ultravioletspectrophotometry,Uv)檢測(cè)血清和各組織中PQ水平,評(píng)估PD對(duì)各組織內(nèi)PQ的清除作用。結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)一:正常對(duì)照組全部大鼠在觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化,進(jìn)食進(jìn)水正常,行動(dòng)反應(yīng)敏捷,毛發(fā)光滑潔凈,四肢體肌力正常,體重明顯增加;經(jīng)造模后,各染毒組大鼠均于2h后逐漸開(kāi)始出現(xiàn)中毒癥狀,逐漸顯現(xiàn)不同程度精神呆滯、進(jìn)食飲水量減少、行動(dòng)反應(yīng)遲緩、皮毛干澀蓬松、四肢體肌力明顯下降、呼吸急促等現(xiàn)象;于染毒后1~3d上述癥狀顯著加重,是大鼠死亡的高峰期;以低劑量組反應(yīng)最輕,而中、高劑量組則出現(xiàn)不同程度口鼻唇有血性分泌物及肢體末端紫紺現(xiàn)象,并逐漸出現(xiàn)呼吸困難等缺氧表現(xiàn),癥狀嚴(yán)重者死亡。從病理HE染色來(lái)看,所有染毒大鼠肺內(nèi)均有肺間質(zhì)增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維蛋白滲出增加,大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷破壞等病理改變,低劑量組病理變化較中、高劑量組相似,但程度較輕,均可認(rèn)為達(dá)到制備急性PQ中毒大鼠模型的要求。本研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)周期為1周,從大鼠死亡率來(lái)看,高劑量組在7天內(nèi)死亡7只,中劑量組在7天內(nèi)死亡6只,而小劑量組則在7天內(nèi),死亡1只。綜合來(lái)看,符合我們進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間上的要求應(yīng)以25mg/kg的染毒劑量進(jìn)行染毒,故采用25mg/kg的染毒劑量來(lái)制備急性PQ中毒大鼠染毒模型。(2)實(shí)驗(yàn)二:Uv法定量檢測(cè)染毒大鼠血清中PQ濃度線(xiàn)性范圍為在0.08~10μg/mL,回歸方程為y=0.0935x+0.2964,其相關(guān)系數(shù)(r)為0.9955,回收率為90.63%~103.0%,RSD為3.6%~8.12%,日內(nèi)及日間RSD波動(dòng)于1.1%~5.19%和2.2%~6.04%,檢測(cè)下限為0.05μg/mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)血清PQ濃度,由此可見(jiàn)血清中PQ濃度早期至6h到達(dá)高峰之后逐漸下降,至72h仍可在血清中檢測(cè)出PQ,說(shuō)明其在血清中的濃度可以有助于判斷中毒預(yù)后。在樣本處理過(guò)程中,Uv法采用三氯乙酸直接沉淀蛋白的方法處理大鼠血清樣本,可靠性較高,雜峰干擾少,具有操作簡(jiǎn)便快捷,分析快速,結(jié)果準(zhǔn)確。(3)實(shí)驗(yàn)三:除對(duì)照組外,各組大鼠中毒癥狀相似。1.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察結(jié)果的影響:正常對(duì)照組,全部大鼠在72h實(shí)驗(yàn)期內(nèi)無(wú)任何異常變化,表現(xiàn)良好,實(shí)驗(yàn)期間體重平穩(wěn)增加,染毒組大鼠出現(xiàn)不同程中毒癥狀,PD干預(yù)組癥狀出現(xiàn)相對(duì)較晚,較同時(shí)間點(diǎn)染毒組明顯減輕,癥狀均有不同程度改善。2.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重變化的影響:染毒組大鼠染毒后體重則隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),明顯低于正常對(duì)照組,PD干預(yù)組在給予藥物干預(yù)后,延緩了中毒大鼠體重下降的趨勢(shì),與染毒組大鼠體重比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺濕干重比(W/D)水平的影響:在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)染毒組肺W/D隨著中毒時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸明顯高于對(duì)照組,PD干預(yù)組與染毒組比較,各時(shí)間點(diǎn)W/D水平升高幅度明顯降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清及各組織中PQ濃度的影響:染毒后不同時(shí)間在血、肺、心、肝、腎中PQ分布及含量有明顯差異,均較正常對(duì)照組顯著升高,PD干預(yù)后各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于染毒組,然后呈現(xiàn)出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降的趨勢(shì),但仍然明顯高于正常對(duì)照組。5.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)指標(biāo)物水平的的影響:染毒組和PD干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)血清MDA、MPO含量均高于正常對(duì)照組,具有顯著差異性(P0.05或P0.01),而CAT、SOD、GSH-PX含量均低于正常對(duì)照組(P0.05或P0.01);PD干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)血清MDA、MPO水平較染毒組降低,抗氧化物的酶類(lèi)CAT、SOD、GSH-Px氧化還原系統(tǒng)水平,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,逐漸較染毒組升高(P0.05或P0.01)。6.PD對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清及肺組織中炎癥細(xì)胞因子含量的影響:與正常對(duì)照組比較,染毒組各時(shí)間點(diǎn)肺組織HYP、NF-κB含量呈逐漸增高趨勢(shì)(P0.05或P0.01),PD干預(yù)組與染毒組比較,肺組織HYP、NF-κB含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01);與正常對(duì)照組比較,染毒組各時(shí)間點(diǎn)血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01);與染毒組比較,PD干預(yù)組血清中TGF-β1、IL-6、TNF-α含量在各時(shí)間點(diǎn)升高幅度明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05或P0.01)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用一次性灌胃方法成功建立了急性PQ中毒大鼠模型。鑒于紫外分光光度法的實(shí)用性、可靠性較高,可以穩(wěn)定用于大鼠中毒模型的血液樣本PQ濃度的多次檢測(cè)。PQ中毒大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng),血液PQ濃度極低或檢測(cè)不到,所以,血液PQ濃度或許不能單獨(dú)作為判斷其中毒嚴(yán)重程度以及預(yù)后的指標(biāo)。PD可以明顯減輕肺干濕比、血漿和各組織PQ濃度、減輕肺組織及血清脂質(zhì)過(guò)氧化物和炎癥因子在急性PQ中毒大鼠組織及血漿中的水平,來(lái)減輕PQ所致的急性肺損傷反應(yīng),可能與其有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子釋放等功能有密切關(guān)系,具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

死亡 1 只。本研究的正式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了 3d 的實(shí)驗(yàn)周期，但需要所有大鼠均能存活，綜合來(lái)看，符合我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)間上的要求應(yīng)以 25mg/kg 的染毒劑量進(jìn)行染毒，故采用 25mg/kg 的染毒劑量來(lái)制備急性 PQ 中毒大鼠染毒模型。3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織病理特點(diǎn)觀察3.3.1 肉眼觀察；按設(shè)計(jì)方案處死所有存活的大鼠，發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量組的大鼠肺組織表面均充血腫脹，彈性差，局部有明顯的淤血，低劑量組肉眼變化與中、高劑量組相近，但程度較輕，介于二者之間；低劑量組可見(jiàn)雙肺均有色蒼白、質(zhì)水腫、彈性差，肺表面有索條狀凹溝及突起不平的小結(jié)節(jié)，并可見(jiàn)小囊形成；中劑量組，大鼠肺可見(jiàn)水腫較明顯，肺彈性差、硬度增加，雙肺局部有明顯的大片暗紅色淤血斑；高劑量組的雙肺病變更為明顯，雙肺色褐紅，質(zhì)硬，呈明顯肺實(shí)變樣改變，亦可見(jiàn)彌漫性出血或梗死灶，表面瘢痕牽拉周?chē)�組織明顯，彈性及差，，雙肺布滿(mǎn)散在白色小結(jié)節(jié)。典型變化如圖 1：

3.3.2 光鏡觀察光鏡下觀察肺組織經(jīng)石x彴�埋轻叕�

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