發(fā)布時間：2018-05-11 16:22

  本文選題：類風濕關節(jié)炎 + 京尼平苷�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：目的:類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種廣泛分布于全身的,以手、腕部小關節(jié)多發(fā)的自身免疫性疾病,其錯綜復雜的病因和發(fā)病機理迄今為止仍未完全探明。該病遍布世界各地,各個種族均有發(fā)病,世界平均患病率為1~1.5%,我國患病率為0.34%~0.36%,以女性多發(fā),男女比例1:3,本病在任何年齡段均可出現(xiàn),以30至50歲發(fā)病最為常見。隨著病程的發(fā)展,致殘率不斷增加,已成為導致我國青壯年勞動力喪失的主要疾病之一。RA的傳統(tǒng)治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、糖皮質激素類藥物和改善病情的抗風濕藥三大類,這些藥物主要用于控制和緩解疾病癥狀,長期用藥會產生嚴重的不良反應。本實驗室研究報道,梔子及其單體京尼平苷(geniposide,Ge)能夠顯著抑制CIA大鼠血清中的致炎細胞因子IL-1β和TNF-α水平,Ge可以通過誘導細胞凋亡從而抑制CIA大鼠滑膜細胞增殖。巨噬細胞可通過分泌多種炎癥介質、基質金屬蛋白酶、細胞因子和生長因子等在RA關節(jié)破壞中發(fā)揮著重要的作用。京尼平苷屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物,又名梔子苷,主要存在于梔子、杜仲等中藥植物中,其主要作用為抗炎、抗腫瘤、抗血栓、保護神經元,此外對于骨質疏松的治療也有一定的療效。本實驗采用佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)誘導單核THP-1細胞分化為巨噬細胞,在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的刺激下,巨噬細胞培養(yǎng)上清液造成滑膜細胞RSC-364炎癥模型后,加入不同濃度的京尼平苷,研究京尼平苷對巨噬細胞上清液刺激后RSC-364細胞及其信號轉導通路的影響,以便進一步對該藥物的特性和機理進行探討和說明。方法:1佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)誘導單核細胞THP-1分化為巨噬細胞后,加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激獲取培養(yǎng)上清液。2將大鼠滑膜細胞RSC-364分為對照(培養(yǎng)基)組,模型(上清液)組,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組(1×10-6 mol/L),京尼平苷高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)和低(1×10-7 mol/L)三種劑量組,共六組。采用MTT法檢測滑膜細胞增殖,分別觀察滑膜細胞在24h、48h和72h后的細胞增殖率。3將分別給藥后的RSC-364滑膜細胞繼續(xù)培養(yǎng)72h,用Hoechst 33342和AO-PI雙染分別進行細胞染色。在熒光顯微鏡下觀察給予三種不同濃度京尼平苷藥物后凋亡和壞死的RSC-364滑膜細胞的形態(tài)學改變。4用流式細胞儀測定對照組,模型組,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中的RSC-364細胞中的總DNA含量并計算細胞凋亡率。5用ELISA法分別測定對照組,模型組,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細胞上清液中的TNF-?、IL-1?、IL-6、IL-10、MMP-3和MMP-9濃度表達水平。6放射免疫法分別測定對照組,模型組,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細胞內環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)蛋白水平。7分別提取對照組,模型組,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細胞的總RNA并進行定量和純度測定,引物設計,用RT-PCR法測定各組細胞中的Gs、Gi基因的m RNA表達。8分別提取對照組,模型組,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L),Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)各組中RSC-364滑膜細胞的總蛋白并進行定量,并用免疫印跡技術(Western Blot)檢測總JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表達以及磷酸化的JNK1/2、ERK1/2、p38的蛋白表達。結果:1經PMA誘導48h后的人單核細胞株THP-1細胞完全貼壁,細胞表面有偽足生成。加入巨噬細胞上清液刺激后的RSC-364滑膜細胞的生長速度較對照組(Control)明顯加快。2 Ge連續(xù)作用72h,與對照組(Control)相比,模型組(Model)RSC-364滑膜細胞增殖率明顯增加(P0.01)。與模型組(Model)相比,24h和48h時MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)、Ge高劑量(1×10-5 mol/L)、Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)和Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)五組中RSC-364滑膜細胞增殖率顯著降低(P0.01或P0.05),72h時MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)、Ge高劑量(1×10-5 mol/L)、Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)三組中RSC-364滑膜細胞增殖率明顯降低(P0.01)。3經AO-PI染色后,對照組(Control)和模型組(Model)中大部分RSC-364滑膜細胞呈現(xiàn)出均勻的綠色熒光。Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)、Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)、Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)和MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)四組中出現(xiàn)橘黃色的凋亡細胞和紅色的死亡細胞,胞膜皺褶,胞核固縮或破裂,以MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)中凋亡細胞最多;經Hoechst33342染色后,對照組(Control)和模型組(Model)中大部分滑膜細胞呈現(xiàn)出均勻的、低強度的淡藍色熒光。隨著Ge藥物濃度的增加,染色體DNA發(fā)生斷裂并相互聚集,并出現(xiàn)凋亡小體,細胞呈現(xiàn)出強度較高的亮藍色熒光,以MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)最為明顯。4對照組(Control)和模型組(Model)細胞凋亡率分別為3.8%和4.3%,而Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)為31.3%,Ge中劑量組(1×10-6 mol/L)為26.5%,Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)為9.3%,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)為35.6%,可見,與對照組(Control)和模型組(Model)相比,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)三個劑量組和MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均可使RSC-364滑膜細胞凋亡率上升。5與對照組(Control)相比,模型組(Model)中的IL-1?,TNF-?、IL-6、MMP-3和MMP-9濃度水平均有明顯升高(P0.01)。與模型組(Model)比較,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge三個劑量組中的IL-1?,TNF-?、IL-6、MMP-3和MMP-9濃度水平有不同程度的降低(P0.01或P0.05)。與對照組(Control)相比,模型組(Model)中的IL-10濃度水平明顯下降(P0.01)。與模型組(Model)比較,IL-10表達水平隨Ge濃度的增加呈劑量依賴性升高,以Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)最為明顯。6與對照組(Control)相比,模型組(Model)中c AMP水平有明顯下降(P0.01)。與模型組(Model)比較,c AMP濃度水平隨Ge濃度增加呈劑量依賴性升高(P0.01或P0.05),以Ge高劑量組(1×10-5 mol/L)最為明顯(P0.01)。與模型組(Model)相比,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)c AMP水平明顯升高(P0.01)。7與對照組(Control)相比,模型組(Model)中Gi m RNA基因表達明顯上升(P0.01)。與模型組(Model)比較,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)劑量組及MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均對滑膜細胞Gi m RNA基因表達有顯著抑制作用(P0.01)。與對照組(Control)相比,模型組(Model)中Gs m RNA基因表達明顯降低(P0.01)。與模型組(Model)比較,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)劑量組及MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)均可上調滑膜細胞Gs m RNA基因表達水平(P0.01或P0.05),而Ge低劑量組(1×10-7 mol/L)效果不明顯(P0.05)。8與對照組(Control)相比,模型組(Model)中p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達明顯增強(P0.01)。與模型組(Model)相比,Ge高(1×10-5 mol/L)、中(1×10-6 mol/L)、低(1×10-7 mol/L)三劑量組均可有效抑制p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(P0.01或P0.05)。與模型組(Model)比較,MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)可以顯著降低p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達(P0.01)。MTX陽性藥物組(1×10-6 mol/L)和Ge不同濃度組對p38、JNK1/2、ERK1/2的蛋白水平無明顯影響。結論:1通過體外誘導單核細胞THP-1為巨噬細胞,用LPS刺激其分泌IL-1?,TNF-?等炎癥因子,能夠使RSC-364滑膜細胞過度增殖。2京尼平苷能夠有效降低RSC-364細胞在炎癥環(huán)境下的滑膜細胞增殖,同時影響相應促炎癥因子和相關蛋白的產生和分泌。3京尼平苷通過提高Gs基因的m RNA表達,降低Gi基因的m RNA表達,使c AMP生成增加,降低RSC-364滑膜細胞的增殖和分泌。提示Ge可能通過調節(jié)G蛋白偶聯(lián)信號轉導通路發(fā)揮抗炎作用。4京尼平苷能夠有效抑制炎癥因子誘導的RSC-364滑膜細胞中p-p38、p-JNK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達。提示Ge可能通過抑制MAPKs信號轉導通路活化,進一步抑制滑膜細胞的增殖和分泌。
[Abstract]:Objective : Rheumatoid arthritis ( RA ) is a kind of autoimmune disease which is widely distributed over the whole body , with small joint of hand and wrist . The disease is the most common disease in China . Methods : 1 脳 10 - 6 mol / L , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) and low ( 1 脳 10 - 7 mol / L ) . In the control group , the model group , the MTX positive drug group ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , the low ( 1 脳 10 - 7 mol / L ) , the medium ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) and the low ( 1 脳 10 - 7 mol / L ) group were respectively extracted from the control group , the model group , the MTX positive drug group ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , the low ( 1 脳 10 - 7 mol / L ) group . Results : 1 脳 10 - 6 mol / L , Ge ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , Ge ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , Ge ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) , Ge ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) and Ge ( 1 脳 10 - 6 mol / L ) group showed a significant decrease in proliferation rate ( P0.01 ) . Compared with the control group , the concentration of IL - 1 , TNF - 偽 , IL - 6 , MMP - 3 and MMP - 9 in the model group increased significantly ( P0.01 ) . Compared with the control group ( Control ) , the levels of IL - 1 ? , TNF - ? , IL - 6 , MMP - 3 and MMP - 9 in the model group increased significantly ( P0.01 ) . Compared with the control group ( Model ) , the levels of IL - 1 ? , TNF - ? Compared with the control group , the expression level of the mRNA in the model group increased significantly ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of the mRNA in the model group increased significantly ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of the protein in the model group was significantly increased ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of the protein in the model group was significantly increased ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of the protein in the model group was significantly higher than that in the control group ( P0.01 ) . Conclusion : 1 脳 10 - 6 mol / L can effectively inhibit the proliferation and secretion of p - p38 , p - N 1 / 2 , p - 1 / 2 . Conclusion : 1 脳 10 - 6 mol / L can effectively inhibit the proliferation and secretion of p - p38 , p - N 1 / 2 , p - 1 / 2 by regulating G protein coupled signal transduction pathway .

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

【參考文獻】

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本文編號：1874685