發(fā)布時(shí)間：2018-05-09 02:01

  本文選題：TNFR-Fc + CTLA4-FasL��； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種主要累及關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾病,由于自身免疫系統(tǒng)紊亂,導(dǎo)致活動(dòng)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生,引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的侵蝕和破壞。RA的病因不明,發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,有許多致病環(huán)節(jié)和因素相互作用,促炎性細(xì)胞因子TNF-α和自身反應(yīng)性T細(xì)胞被認(rèn)為在RA發(fā)病機(jī)制中起了很重要的作用。其中,炎性細(xì)胞因子TNF-α在RA關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)高表達(dá),能促使滑膜細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子,引起炎癥反應(yīng)并能夠明顯促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖,造成組織損傷,因此,抑制TNF-α的促炎作用對(duì)于有效治療RA至關(guān)重要;浸潤(rùn)在RA患者關(guān)節(jié)腔和滑膜組織中的炎性細(xì)胞以CD4+T細(xì)胞為主,在RA病程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,因此拮抗T細(xì)胞是治療RA的一種有效策略。近年來,TNF拮抗劑逐漸應(yīng)用于RA臨床治療,其中蛋白治療藥物Etanercept(依那西普,商品名Enbrel)(p75 TNFR-Fc融合蛋白)在臨床上獲得了很好的療效,但是依然有一部分患者對(duì)此種治療沒有效果或者效果不明顯,亟需更有效并改進(jìn)的替代療法�；�于有多種致病因素參與RA的發(fā)生發(fā)展,發(fā)病機(jī)制具有復(fù)雜性,單一因素的拮抗很難達(dá)到理想的治療效果,聯(lián)合阻斷不同致病因素已成為很有吸引力的治療策略。有研究表明,針對(duì)T細(xì)胞和TNF的聯(lián)合阻斷,可能比TNF的單獨(dú)阻斷能夠取得更理想的RA治療效果。有研究證明,TNF拮抗劑與T細(xì)胞拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用,能夠顯著增強(qiáng)TNF拮抗劑對(duì)RA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的治療效果。因此,應(yīng)用TNF拮抗劑和T細(xì)胞拮抗劑聯(lián)合治療RA的策略具有廣闊的發(fā)展前景�；�因治療是指將外源治療性基因?qū)�入靶�?xì)胞,以糾正或補(bǔ)償由于基因缺陷或異常而引起的疾病,從而達(dá)到治療的目的。即通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將外源治療性基因轉(zhuǎn)入病人的受體細(xì)胞中,使外源治療性基因發(fā)揮有效作用而治療疾病�；�于基因治療的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn),并且RA是一種局部關(guān)節(jié)受累的自身免疫性疾病,因此本研究擬采用局部基因治療方法進(jìn)行RA聯(lián)合治療的相關(guān)研究。在基因遞送載體的選擇上,腺相關(guān)病毒(AAV)載體具有免疫原性低,轉(zhuǎn)染效率高,能夠介導(dǎo)目的基因長(zhǎng)期表達(dá)等特點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)AAV有十幾種血清型,其中AAV2是目前常用的穩(wěn)定應(yīng)用于臨床治療的血清型,在國(guó)內(nèi)包裝和純化技術(shù)成熟,因此,我們借助于AAV2載體進(jìn)行RA的基因治療研究。RA治療最重要的方式就是誘導(dǎo)免疫耐受,抑制T細(xì)胞的激活。本課題組前期成功構(gòu)建了AAV2介導(dǎo)的CTLA4-Fas L融合分子,其中,CTLA4功能域能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7,阻斷T細(xì)胞激活的共刺激信號(hào),誘導(dǎo)耐受;Fas L功能域能夠誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡,從而通過抑制激活和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮對(duì)T細(xì)胞的雙重抑制作用。在本課題前期研究中,我們證明腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)的CTLA4-Fas L基因能夠有效抑制大鼠佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎,并且能夠顯著減少大鼠關(guān)節(jié)中自身反應(yīng)性T細(xì)胞浸潤(rùn),抑制滑膜增生,并進(jìn)一步證明CTLA4-Fas L融合分子比單獨(dú)Fas L分子能更有效地控制大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。基于上述研究背景,本課題研究的目的是選取拮抗TNF的融合基因TNFR-Fc和拮抗T細(xì)胞的融合基因CTLA4-Fas L,構(gòu)建腺相關(guān)病毒載體AAV2介導(dǎo)的TNFR-Fc和CTLA4-Fas L融合分子,并創(chuàng)新性地在兩組融合基因之間引入自剪切多肽furin和2A,能夠介導(dǎo)上下游融合基因在同一載體、同一開放閱讀框(ORF)中同時(shí)、均衡、獨(dú)立表達(dá),并對(duì)兩組融合基因協(xié)同抑制大鼠佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AIA)的炎癥反應(yīng)及相關(guān)免疫學(xué)作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討。首先,我們將TNFR-Fc融合基因克隆入AAV2載體上,構(gòu)建成AAV2.TNFR-Fc(命名為TRFC)重組質(zhì)粒,驗(yàn)證重組質(zhì)粒在體外細(xì)胞模型中獲得分泌性表達(dá),并對(duì)TNFR-Fc目的蛋白中和rat TNFα的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。隨后,我們將furin裂解位點(diǎn)和2A自剪切序列通過4輪overlap PCR克隆入課題組前期構(gòu)建的CTLA4-Fas L融合基因,構(gòu)建成furin-2A-CTLA4-Fas L融合基因,將此融合基因通過相應(yīng)酶切位點(diǎn)克隆入TRFC重組質(zhì)粒中,從而構(gòu)建成我們最終所需的AAV2介導(dǎo)的雙融合分子TNFR-Fc(furin-2A)CTLA4-Fas L重組質(zhì)粒(命名為TFCF);接下來將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,收獲的無血清上清經(jīng)Western Blot和ELISA進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證重組質(zhì)粒TFCF在體外細(xì)胞模型中獲得平行獨(dú)立共表達(dá)。最后,我們將AAV2介導(dǎo)的雙融合分子重組質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝,應(yīng)用局部基因治療的方式,將包裝后的重組病毒注射到佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AIA)大鼠的關(guān)節(jié)腔內(nèi),從免疫后第11天發(fā)病起,觀察重組病毒協(xié)同抑制大鼠關(guān)節(jié)炎的臨床形態(tài)學(xué)和組織學(xué)指標(biāo),并通過免疫組化,炎性細(xì)胞因子檢測(cè),實(shí)時(shí)定量PCR,脾臟活性檢測(cè)等進(jìn)行相關(guān)分子機(jī)制研究。研究結(jié)果表明,(1)成功構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒p AAV2/TNFR-Fc,驗(yàn)證TNFR-Fc融合基因在體外細(xì)胞模型中獲得分泌性表達(dá),并證明TNFR-Fc目的蛋白具有中和大鼠TNFα介導(dǎo)的對(duì)L929細(xì)胞的殺傷活性;(2)將furin裂解位點(diǎn)和2A自剪切序列融合入CTLA4-Fas L基因中,并克隆入TRFC重組質(zhì)粒中,構(gòu)建成p AAV2/TNFR-Fc(furin 2A)CTLA4-Fas L重組質(zhì)粒(命名為TFCF),并驗(yàn)證TFCF重組質(zhì)粒在體外細(xì)胞模型中獲得兩組融合基因的平行獨(dú)立共表達(dá);(3)接下來觀察雙融合分子重組病毒在實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)的表達(dá)和治療作用,結(jié)果表明,furin和2A自剪切多肽在AAV.TFCF病毒上發(fā)揮了有效的切割作用,使上下游基因在關(guān)節(jié)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了平行獨(dú)立、均衡共表達(dá);(4)通過觀察踝關(guān)節(jié)指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹厚度等臨床形態(tài)學(xué)指標(biāo),以及HE染色和番紅O固綠等組織學(xué)指標(biāo)結(jié)果表明,雙融合分子比單融合分子能夠更有效降低大鼠關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腫脹程度,抑制炎癥反應(yīng)和滑膜增生;(5)我們對(duì)雙融合分子治療RA相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了研究和探討,通過炎性細(xì)胞因子檢測(cè),證明雙融合分子能夠明顯促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子分泌,抑制促炎細(xì)胞因子水平,從而控制炎癥的持續(xù)發(fā)展;通過免疫組化檢測(cè)關(guān)節(jié)內(nèi)CD4基因和TNFα基因水平,證明雙融合分子組在抑制炎性細(xì)胞包括自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)方面,要顯著優(yōu)于其他兩個(gè)單融合分子組,并且能夠更有效下調(diào)關(guān)節(jié)內(nèi)TNFα蛋白水平;流式檢測(cè)引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+Fox P3+Treg細(xì)胞結(jié)果表明,雙融合分子TNFR-Fc和CTLA4-Fas L聯(lián)合抑制大鼠關(guān)節(jié)炎的作用,部分地取決于上調(diào)引流淋巴結(jié)中CD4+CD25+Fox P3+Treg細(xì)胞水平相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制;同時(shí)通過脾細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明,與單融合分子相比,雙融合分子能夠顯著抑制脾細(xì)胞的增殖率,改善脾腫大的癥狀,并且能夠抑制與RA病情密切相關(guān)的信號(hào)分子NO的產(chǎn)生。本研究構(gòu)建了一種新型表達(dá)系統(tǒng),采用AAV2基因遞送載體,創(chuàng)新性地引入furin和2A自剪切多肽,成功構(gòu)建了新型雙融合分子p AAV2/TNFR-Fc(Furin 2A)CTLA4-Fas L,能夠同時(shí)獨(dú)立表達(dá)兩種抗炎蛋白TNFR-Fc和CTLA4-Fas L,從體內(nèi)細(xì)胞與分子機(jī)制研究入手,通過各種形態(tài)學(xué)和組織學(xué)等臨床觀察指標(biāo),以及ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平等相關(guān)檢測(cè),充分證明這種新型雙融合分子的協(xié)同抗炎效應(yīng),從而提出CTLA4-Fas L聯(lián)合TNF抑制劑TNFR-Fc協(xié)同治療RA的新思路,為治療RA提供新策略,為臨床新藥研發(fā)提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that the combination of TNF - 偽 and T - cell antagonist has played a key role in the treatment of RA . AAV2 - mediated gene TNFR - Fc was cloned into the fusion gene of rat ' s adjuvant induced arthritis ( AAV2 ) . The results showed that the recombinant plasmid pAAV2 / TNFR - Fc was successfully constructed . The novel double fusion molecule p AAV2 / TNFR - Fc ( Furin 2A ) 4 - Fas L was successfully constructed . Two anti - inflammatory proteins TNFR - Fc and 4 - Fas L could be expressed independently at the same time .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1864060