發(fā)布時間：2018-05-08 15:26

  本文選題：類風濕關節(jié)炎 + 成纖維細胞樣滑膜細胞　； 參考：《揚州大學》2016年碩士論文

【摘要】：目的類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是以滑膜炎為其基本病理改變的慢性全身性自身免疫性疾病。位于RA患者滑膜襯里層的成纖維細胞樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes, FLS)具有類似于腫瘤細胞的與細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)的黏附、遷移和侵襲的特征,在RA的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。課題組先前的研究顯示金雀異黃素(genistein, Gen)能夠抑制CIA大鼠FLS的增殖,抑制炎癥因子(TNF-α IL-1β)的分泌,并有控制CIA大鼠的關節(jié)炎癥、抑制CIA大鼠關節(jié)破壞的作用。且相關文獻報道顯示Gen可以抑制腫瘤細胞與ECM黏附及遷移、侵襲。故本實驗旨在探究Gen對RA-FLS與ECM的黏附、遷移和侵襲的影響及其可能存在的機制。方法1、以人類風濕關節(jié)炎成纖維細胞樣滑膜細胞株(MH7A)作為研究對象,應用CCK8細胞活力實驗研究不同濃度Gen對RA-FLS細胞活力的影響,選取對RA-FLS細胞活力無明顯影響的濃度進行研究。2、通過RA-FLS與ECM類似物(Collagen Ⅰ、Fibronectin、Matrigel)的黏附,研究Gen對RA-FLS與ECM黏附的影響。3、通過細胞劃痕實驗、transwell細胞遷移實驗研究Gen對RA-FLS遷移的影響；4、通過transwell細胞侵襲實驗研究Gen對RA-FLS侵襲的影響。5、通過羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對RA-FLS的F-actin細胞骨架系統(tǒng)進行染色,觀察Gen對RA-FLS肌動蛋白纖維的分布、絲狀和片狀偽足形成的影響。6、應用Western Blot檢測相關信號通路蛋白及MMP-2的表達水平以探究其中可能存在的機制。研究結果1、細胞活力實驗的結果表明Gen在20μM、40μM、60 μM組測得的細胞活力相較于空白對照組分別為98.30±2.90%、95.70±5.65%和92.70±7.01%,對RA-FLS的細胞活力均無明顯影響(p0.05),故選取20 μM、40μM、 60 μM濃度的Gen進行進一步實驗。2、與ECM類似物的黏附實驗結果表明,與對照組相比,RA-FLS在20 μM、40 μM、60μM組與Collagen I的黏附率分別為97.43±1.18%、88.92±4.23%及78.25±4.90%,與Fibronectin的黏附率分別為95.18±2.00%、89.35±2.35%、78.43±3.27%,與Matrigel的黏附率分別為96.35±2.13%、84.96±3.21%、75.82±1.38%；Gen在40μM、60μM對RA-FLS與Collagen Ⅰ、Fibronectin、Matrigel的黏附均有明顯的抑制作用(p0.05),且在60μM時均較40μM時明顯(p0.05),而20μM時對其黏附無明顯影響(p0.05)。3、細胞劃痕實驗結果表明,Gen在20μM,40 μM,60μM均可以抑制傷痕的愈合,且隨著濃度的增加抑制作用越強；在transwell細胞遷移實驗中, RA-FLS在20μM、40μM60μM的遷移率相較于空白對照組分別為97.10±5.16%、77.97±5.44%及51.95±5.26%；40μM、60μM的Gen對RA-FLS的遷移均有明顯的抑制作用(p0.05),且60 μM時更為明顯(p0.05),但201μM時對其遷移無明顯影響(p0.05)。4、Transwell細胞侵襲實驗結果表明,RA-FLS在20 μM,40 μM,60 μM的細胞侵襲數(shù)目相較于空白對照組分別為94.79±5.24%、64.54±10.13%及51.32±12.36%；40μM、60μM對RA-FLS的侵襲均有明顯的抑制作用(p0.05),且60 μM更為明顯(p0.05),而20 μM對其侵襲無明顯影響(p0.05)。5、免疫熒光染色實驗的結果顯示Gen能夠使RA-FLS肌動蛋白細胞骨架重排,使張力纖維數(shù)目增多,片狀偽足和絲狀偽足的數(shù)量減少,且隨著濃度的增加這種作用越強,在60μM濃度最明顯。6、 Western blot的結果顯示,與空白對照組相比Gen在20μM,40μM.60μM對RA-FLS中p-JNK、JNK、p-ERK、ERK水平無明顯影響(p0.05)；Gen在20μM濃度對RA-FLS的p-p38水平無明顯影響(p0.05),但在40 μM,60μM濃度可以下調RA-FLS中p-p38水平(p0.05),而這些濃度對細胞中的p38水平則無明顯影響(p0.05)；并且Gen在這些濃度對RA-FLS中MMP-2的表達水平亦無明顯影響(p0.05)。結論1、Gen在40 μM,60μM濃度時可以抑制RA-FLS與ECM類似物(Collagen Ⅰ、 Fibronectin、Matrigel)的黏附、遷移和侵襲,在20μM濃度時對RA-FLS與ECM類似物(Collagen Ⅰ、Fibronectin、Matrigel)的黏附、遷移和侵襲無明顯影響。2、Gen可能通過下調p-p38水平調控RA-FLS中F-actin細胞骨架纖維的重構,使張力纖維數(shù)目增多,片狀偽足和絲狀偽足的形成減少,從而實現(xiàn)其抑制RA-FLS與ECM類似物(Collagen Ⅰ、Fibronectin、Matrigel)的黏附、遷移和侵襲的作用。
[Abstract]:Objective To investigate the effects of Gen on the adhesion , migration and invasion of RA - FLS and ECM , and to investigate the effects of Gen on the adhesion , migration and invasion of RA - FLS .
4 . The effects of Gen on the invasion of RA - FLS were investigated by transwell cell invasion . The results showed that the cell viability of RA - FLS was 98.30 鹵 2.90 % , 95.70 鹵 5.65 % and 92.70 鹵 7.01 % , respectively , and the adhesion of RA - FLS was 95.18 鹵 2 . 00 % , 89.35 鹵 2.35 % , 78.43 鹵 3.27 % , respectively , and the adhesion rate of RA - FLS was 96.35 鹵 2.13 % , 84.96 鹵 3.21 % , 75.82 鹵 1.38 % , respectively .
The adhesion of Gen at 40 渭M , 60 渭M to RA - FLS was significantly inhibited by adhesion of RA - FLS ( p < 0.05 ) and 40 渭M at 60 渭M ( p < 0.05 ) . The results of cell scratch test showed that Gen 20 渭M , 40 渭M , 60 渭M inhibited wound healing and increased with increasing concentration .
The mobility of RA - FLS was 97.10 鹵 5.16 % , 77.97 鹵 5.44 % and 51.95 鹵 5.26 % , respectively .
The results of invasion and invasion of RA - FLS were 94.79 鹵 5.24 % , 64.54 鹵 10.13 % and 51.32 鹵 12.36 % , respectively .
The results showed that Gen was able to rearrange the cytoskeletal structure of RA - FLS . The results showed that Gen was able to rearrange the cytoskeletal structure of RA - FLS . The results of immunofluorescence staining showed that Gen was able to decrease the number of RA - FLS actin , and the stronger the concentration increased . The results of Western blot showed that Gen was 20 渭M , 40 渭M and 60 渭M in RA - FLS .
The level of p - p38 in RA - FLS was not significantly affected by Gen at 20 渭M ( p < 0.05 ) , but the level of p - p38 in RA - FLS could be downregulated at 40 渭M and 60 渭M ( p < 0.05 ) , while these concentrations did not significantly affect the level of p38 in the cells ( p . 05 ) ;
Conclusion 1 , Gen may inhibit the adhesion , migration and invasion of RA - FLS and ECM analogues in RA - FLS at concentrations of 40 渭M and 60 渭M . Gen may reduce the adhesion , migration and invasion of RA - FLS and ECM analogues ( . I , Fibronectin , Matrigel ) at the concentration of 20 . m

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22

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本文編號：1861945