目的:構(gòu)建肌節(jié)同源盒基因1(Msx1)-Cre小鼠模型。方法:基于CRISPR/Cas9技術(shù),設(shè)計靶向切割Msx1基因啟動子下游的單鏈向?qū)NA(sgRNA),并構(gòu)建包含Cre序列的同源重組片段;構(gòu)建sg RNA載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染至小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3),并在細胞水平驗證sg RNA的打靶效率和脫靶情況;將靶向切割Msx1基因的sg RNA、Cre同源重組片段及Cas9蛋白等混合溶液經(jīng)體外顯微注射至C57BL/6J小鼠的受精卵,3周后獲得小鼠,利用PCR技術(shù)鑒定獲得的F0代Msx1-Cre小鼠,并將構(gòu)建成功的Msx1-Cre模型小鼠與Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,進行功能驗證。結(jié)果:設(shè)計的sg RNA能夠有效定點切割Msx1基因啟動子下游靶位點;成功獲得Msx1-Cre小鼠模型; Msx1-Cre模型小鼠與Rosa26R-mTmG模型小鼠交配,子代小鼠免疫熒光結(jié)果顯示,小鼠綠色熒光蛋白(GFP)特異定位于表達MSX1細胞的細胞膜上。結(jié)論:成功構(gòu)建了Msx1-Cre小鼠模型,可用于示蹤Msx1基因以及在表達MSX1的牙間充質(zhì)細胞中進行條件性敲除或過表達實驗來研究牙發(fā)育過程...

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【部分圖文】：

圖5Msx1-CreF0代小鼠基因型及功能鑒定

在患有Wolf-Hirschhorn綜合征(又稱4p-綜合征)的先天性缺牙患者中發(fā)現(xiàn)其MSX1基因大片段缺失，且有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MSX1基因在頜面部發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，MSX1基因完全缺失不僅會導致切牙不發(fā)育，磨牙發(fā)育停止在蕾狀期，且伴隨顱面部發(fā)育缺陷[14-15]。CRISP....

圖1CRISPR/Cas9介導的Cre基因插入策略圖

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA切割原理[7],sgRNA選擇在Msx1基因的ATG后盡量靠近ATG位點。在CRISPR設(shè)計網(wǎng)站(https://sg.idtdna.com)上選擇打靶分數(shù)高且脫靶率低的sgRNA序列。如圖1所示，5’端同源臂從ATG起始密碼子前開....

圖2構(gòu)建Msx1sgRNA的表達載體

如圖2A，設(shè)計并合成的兩段互補sgRNA序列退火成雙鏈后，在T4連接酶參與的連接反應下接入被BsmBI雙酶切的LentiCRISPRv2質(zhì)粒上，測序結(jié)果顯示sgRNA成功插入質(zhì)粒，如圖2B所示。提取成功構(gòu)建的sgRNA載體質(zhì)粒，進一步通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到NIH3T3細胞中，....

圖3sgRNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞打靶驗證

圖2構(gòu)建Msx1sgRNA的表達載體2.2F0代小鼠的獲得鑒定及功能驗證

本文編號：3997372