獼猴桃潰瘍病是嚴(yán)重危害獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要細(xì)菌性病害,由于致病菌潛伏期不表現(xiàn)病癥,常錯過最佳的防治時(shí)期。為實(shí)現(xiàn)獼猴桃潰瘍病田間無癥帶菌狀態(tài)的早期診斷,本研究對田間快速檢測技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,并采集田間無癥樣本進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明,獼猴桃潰瘍病病健交界處組織用金氏B培養(yǎng)液浸泡8 h可獲得質(zhì)量較高的PCR模板;在PCR反應(yīng)體系中加入φ=10%的甘油能顯著增強(qiáng)擴(kuò)增效果;當(dāng)檢測無癥帶菌樣本時(shí),浸提液中加入Na₂SO₃,26℃浸泡8 h有利于降低PCR反應(yīng)中抑制物的干擾;進(jìn)一步優(yōu)化PCR反應(yīng)中模板DNA的添加量;無癥樣本檢測結(jié)果表明,在獼猴桃孕蕾至開花期的新生枝條中潰瘍病致病菌的檢出率最高,可達(dá)91.8%。本試驗(yàn)優(yōu)化后的PCR特異性分子檢測技術(shù),有助于及早發(fā)現(xiàn)無癥帶菌的獼猴桃潰瘍病病株,對盡早有針對性實(shí)施田間防控具有重要意義。

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【部分圖文】：

圖1不同樣品浸泡液的浸提效果

浸泡液的浸提效果比對結(jié)果顯示(圖1),金氏B浸泡液制備的模板在PCR擴(kuò)增后呈現(xiàn)的DNA靶帶清晰明亮,浸提效果最好,其次分別為樣品PDA培養(yǎng)液、LB培養(yǎng)液、磷酸緩沖液,3次重復(fù)的結(jié)果一致。樣品浸泡時(shí)間篩選的結(jié)果顯示(圖2),浸泡2h和5h均未檢出擴(kuò)增產(chǎn)物,說明浸泡時(shí)間過短;但是....

圖2樣品不同浸泡時(shí)間對比

圖1不同樣品浸泡液的浸提效果2.2PCR反應(yīng)中化學(xué)增強(qiáng)劑的作用效果

圖3化學(xué)增強(qiáng)劑對PCR反應(yīng)的影響

按照文中“1.7”的方法制備潰瘍病檢測樣品模板,通過加入不同模板量,比對PCR擴(kuò)增檢測效果,結(jié)果顯示當(dāng)模板量為1μL、1.5μL和2μL時(shí)均可擴(kuò)增出目標(biāo)靶帶,其中模板量為1μL～2μL效果最好;而模板量為2.5μL、3μL及3.5μL時(shí)均未擴(kuò)增出DNA靶帶(圖....

圖4甘油使用體積分?jǐn)?shù)優(yōu)化

圖3化學(xué)增強(qiáng)劑對PCR反應(yīng)的影響2.5PCR檢測方法在獼猴桃不同發(fā)育期的應(yīng)用效果

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