發(fā)布時間：2020-11-22 09:37

　　 米曲霉是一種常見的發(fā)酵用微生物,廣泛應(yīng)用于制作豆豉及釀造醬油中。醬油釀造根據(jù)發(fā)酵工藝的不同,可分為無鹽固態(tài)發(fā)酵、低鹽固態(tài)發(fā)酵和高鹽稀態(tài)發(fā)酵,現(xiàn)在較為常用的為后兩種。鹽分的存在不僅可以抑制雜菌的生長,還與醬油特殊風(fēng)味的形成密切相關(guān),但是發(fā)酵時的鹽分處理同時也會對米曲霉菌株的生長產(chǎn)生抑制作用,因此有必要對米曲霉進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。目前為止,關(guān)于米曲霉在鹽脅迫下的應(yīng)答機(jī)制鮮有報道,有必要對其進(jìn)行更深入的研究,為改造和選育更適合應(yīng)用的米曲霉菌株提供一定的實踐依據(jù)�；�于上,本課題進(jìn)行了以下方面的研究:1.鹽脅迫下米曲霉的生長及代謝物質(zhì)分析:接種新鮮米曲霉孢子于含0%,5%,10%,15%氯化鈉的PDA培養(yǎng)基中,30℃,培養(yǎng)72 h,以鹽濃度0%為對照,觀察米曲霉的生長情況,測定米曲霉的干生物量和孢子數(shù)量。結(jié)果顯示,對照組干生物量一直處于同時間點最高值,鹽脅迫導(dǎo)致了米曲霉生物量的下降,特別是48 h后,干生物量的變化更加明顯,鹽濃度越高,抑制作用越明顯。15%鹽濃度培養(yǎng)下,36 h之前,基本不生長。但米曲霉在各鹽濃度實驗組平板上的生長趨勢基本一致,在培養(yǎng)60 h后生物量基本不變化,達(dá)到穩(wěn)定期。鹽脅迫下米曲霉分生孢子的產(chǎn)生受到抑制,高鹽度組較為明顯。對培養(yǎng)72 h的米曲霉菌絲體進(jìn)行收集,測定胞內(nèi)脂肪酸種類與含量,并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果顯示,18碳脂肪酸與16碳脂肪酸的含量占米曲霉總脂肪酸含量的95%以上,米曲霉中的主要脂肪酸是棕櫚酸(Palmitic acid,C16:0),硬脂酸(Stearic acid,C18:0),油酸(Oleic acid,C18:1)和亞油酸(Linoleic acid,C18:2)。與0%對照組相比,鹽脅迫組中C18含量略高,C16含量略低,不飽和脂肪酸的含量顯著高于飽和脂肪酸含量。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,與0%對照組相比,在三個鹽度處理組中總共4578個基因顯示出差異表達(dá)水平,其中有848個基因為3個鹽濃度組所共有,15%鹽濃度下的差異基因數(shù)量要明顯多于5%與10%鹽濃度組,表明在15%鹽度組發(fā)生了更為復(fù)雜的生物代謝反應(yīng),結(jié)合代謝通路發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因參與了米曲霉中精氨酸生物合成以及亞油酸生物合成,其中硬脂酸去飽和酶基因表達(dá)水平在5%鹽濃度時明顯上調(diào)。2.鹽脅迫相關(guān)基因在酵母中的功能鑒定:使用qRT-PCR對米曲霉硬脂酸去飽和生成油酸的限速酶基因AoD9D1和AoD9D2進(jìn)行表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),AoD9D1的表達(dá)從適應(yīng)期變?yōu)閷��?shù)期和穩(wěn)定期后逐漸增加,而AoD9D2在適應(yīng)期具有最高表達(dá)水平,在對數(shù)期和穩(wěn)定期表達(dá)較少,AoD9D1和AoD9D2在鹽濃度升高情況下表現(xiàn)出逐漸增加的表達(dá)�；�因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),AoD9D1和AoD9D2均含有FAD和Cyt-b5結(jié)構(gòu)域,進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),米曲霉AoD9D1和AoD9D2明顯屬于兩組,并且兩組都與米曲霉RIB40中的D9D具有較近的親緣關(guān)系,蛋白性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),AoD9D1基因編碼456個氨基酸,分子量約為51.9 kDa,理論等電點為9.10,親水性平均系數(shù)為負(fù)值,具有3個跨膜區(qū)域,AoD9D2基因編碼469個氨基酸,分子量約為53.6 kDa,理論等電點為9.01,親水性平均系數(shù)為負(fù)值,其同樣具有3個跨膜區(qū)域。將AoD9D1和AoD9D2及其結(jié)構(gòu)域共6個基因分別進(jìn)行載體構(gòu)建,使用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化野生型和D9D敲除釀酒酵母,進(jìn)行液體發(fā)酵及脂肪酸含量測定。結(jié)果顯示,異源表達(dá)AoD9D1和AoD9D2基因提高了野生型釀酒酵母的耐鹽性,其中異源表達(dá)AoD9D1基因的菌株耐鹽性要略強(qiáng)于異源表達(dá)AoD9D2基因的菌株耐鹽性。與野生型相比,D9D敲除的酵母菌株表現(xiàn)出較低的耐鹽性,當(dāng)AoD9D1和AoD9D2轉(zhuǎn)化到D9D敲除菌株中時,鹽耐受性在7%及更高濃度下明顯增強(qiáng),且AoD9D1轉(zhuǎn)化菌株比AoD9D2轉(zhuǎn)化菌株具有更高的耐鹽性。在5%低鹽濃度時,結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化酵母的生長均受到了不同程度的抑制,而隨著鹽濃度的升高,AoD9D1基因的兩個結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化菌株表現(xiàn)更強(qiáng)的鹽脅迫耐受性,而AoD9D2基因的兩個結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化菌株則無此效果。以上酵母菌株脂肪酸數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),異源表達(dá)AoD9D釀酒酵母中不飽和脂肪酸,包括棕櫚油酸和油酸的含量明顯增高,而飽和脂肪酸,主要包括棕櫚酸和硬脂酸的含量則減少,異源表達(dá)AoD9D1菌株中脂肪酸含量的變化比異源表達(dá)AoD9D2菌株更明顯。相較于AoD9D2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)化株,AoD9D1結(jié)構(gòu)域的野生型和D9D敲除釀酒酵母轉(zhuǎn)化株呈現(xiàn)出較高水平的不飽和脂肪酸含量。3.AoD9D1基因在米曲霉中的過表達(dá)及表型分析:鑒于AoD9D1基因提高酵母耐鹽性的積極作用,構(gòu)建了基因在米曲霉中過量表達(dá)的載體,載體上帶有紅色熒光,便于對基因表達(dá)進(jìn)行定位。采用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化米曲霉,進(jìn)行基因表達(dá)定位及菌株脅迫耐受性實驗。結(jié)果顯示,AoD9D1基因在米曲霉中過表達(dá)定位于細(xì)胞膜上,基因過表達(dá)菌株顯示出比野生型更強(qiáng)的繁殖能力和鹽脅迫耐受性。4.AoD9D1基因作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究:利用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測出10個與AoD9D1基因編碼去飽和酶存在相互作用的蛋白。進(jìn)行相關(guān)載體構(gòu)建,通過酵母雙雜交系統(tǒng)對AoD9D1基因作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶與AoD9D1基因所編碼的蛋白存在著蛋白之間的相互作用。
【學(xué)位單位】：江西科技師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ920.6;TS201.3
【部分圖文】：

圖 1-1 米曲霉不飽和脂肪酸合成途徑Fig. 1-1 Synthesis of unsaturated fatty acids in Aspergillus oryzae1.4 本文主要工作本課題旨在對米曲霉在鹽脅迫下的應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行研究，并對篩選出的個別差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能驗證，主要工作如下：1．鹽脅迫下米曲霉的生長及代謝物質(zhì)分析：在 0%，5%，10%，15%鹽度PDA 培養(yǎng)基中對米曲霉進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄生長情況，并對菌體進(jìn)行脂質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組分析。2．鹽脅迫相關(guān)基因的功能鑒定：通過將脂質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的分析數(shù)據(jù)同米曲霉代謝通路相結(jié)合，選定兩個米曲霉脂肪酸去飽和酶基因作為主要研究對象。分別構(gòu)建了兩個基因的酵母真核表達(dá)載體，通過在釀酒酵母中的過表達(dá)及回補(bǔ)

第 2 章 鹽脅迫下米曲霉的生長及代謝物質(zhì)分析對鹽脅迫培養(yǎng)后的米曲霉菌絲體干燥至恒重，分析天平稱量。結(jié)果如圖 2所示。以 0%的鹽濃度為對照組，與對照組干生物量一直處于同時間點最高值相比，鹽脅迫導(dǎo)致了米曲霉生物量的下降，特別是 48 h 后，干生物量的變化更加明顯，鹽濃度越高，抑制越明顯。15%鹽濃度培養(yǎng)下，36 h 之前，基本不生長。但是米曲霉在各鹽濃度實驗組平板上的生長趨勢基本一致，在培養(yǎng) 60 h 后生物量基本不變化，達(dá)到穩(wěn)定期。

圖 2-2 鹽脅迫下米曲霉表型左：5%鹽濃度下培養(yǎng) 72 小時；右：0%鹽濃度下（對照）培養(yǎng) 72 小時Fig. 2-2 The phenotype of A. oryzae under salt stressLeft: The phenotype of A. oryzae after 72 h in the 5% salinity treatment; Right: The phenotypeof A. oryzae after 72 h in the 0% salinity treatment (control)鹽脅迫下米曲霉孢子濃度變化如圖 2-3 所示。在最初的 36 h 中，在 5%和10%鹽度處理中產(chǎn)生的分生孢子比 0%對照中更多，但是這種趨勢在培養(yǎng) 48 h后逆轉(zhuǎn)，在整個培養(yǎng)過程中，15%高鹽度組中的分生孢子形成受到顯著抑制。結(jié)果表明鹽脅迫下米曲霉分生孢子的產(chǎn)生受到抑制，高鹽度組較明顯。
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本文編號：2894496