維生素C(Vc)是人體所需的重要水溶性維生素,在食品行業(yè)中有著重要的應用價值,其衍生物通常作為抗氧化劑、營養(yǎng)強化劑添加在食品中。維生素C的前體物質2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)可通過微生物發(fā)酵的方法獲得,這種方法稱為二步發(fā)酵法,二步發(fā)酵法的第二步為混菌發(fā)酵,其中包括作為伴生菌的芽孢桿菌和作為產酸菌的普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare),兩菌的關系為互利共生,但互作機制還不完全明確。已知多種芽孢桿菌均可作為伴生菌,但伴生效果各不相同,對混菌發(fā)酵過程伴生菌解除產酸菌氧化脅迫機制的解析,和對不同伴生菌伴生效果不同機制的解析,將有助于探究兩菌互作的分子機制,為后續(xù)利用生物學手段提升維生素C發(fā)酵生產水平奠定堅實的理論基礎和方法學基礎,同時還可為其他復雜微生物群落的研究提供線索。本文主要研究結果如下:首先對Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1單菌及Vc混菌發(fā)酵體系的生理特性進行分析,發(fā)現(xiàn)B.endophyticus ST-1促進了K.vulgare 25B-1的生長和產酸,同時K.vulgare 25B-1促進了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,在發(fā)酵后期,發(fā)酵體系2-KLG產量逐漸增多,影響了B.endophyticus ST-1的生長;混菌發(fā)酵中B.endophyticus ST-1芽孢2,6-吡啶二羧酸(2,6-pyridinedicarboxylic acid,DPA)的含量高于單菌發(fā)酵,K.vulgare 25B-1促進了伴生菌芽孢的生成;混菌發(fā)酵體系pH值比單菌發(fā)酵體系穩(wěn)定,有利于K.vulgare 25B-1的生長于產酸;混菌發(fā)酵體系的氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)隨著發(fā)酵的進行,逐漸降低,并且與2-KLG產量呈現(xiàn)顯著負相關。在K.vulgare 25B-1中,獲得4個山梨糖脫氫酶基因Kvsdh1、Kvsdh2、Kvsdh3、Kvsdh4和1個山梨酮脫氫酶基因Kvsndh1,這兩種酶與2-KLG的生成相關;生物信息學分析顯示,這5種蛋白的穩(wěn)定性較好,為水溶性蛋白,僅Kvsdh1編碼蛋白為膜結合蛋白,四個山梨糖脫氫酶的三級結構形態(tài)類似,并在Kvsdh1編碼蛋白的三級結構中預測到一個鈣結合位點和一個吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)結合位點,Kvsdh4編碼蛋白的三級結構中也存在一個PQQ結合位點。在混菌發(fā)酵中山梨糖脫氫酶基因的表達和酶活逐漸升高在40 h達到最高,隨后下降;山梨酮脫氫酶基因的表達在混菌發(fā)酵中逐漸升高在66 h達到最高。分析混菌發(fā)酵體系對自身氧化脅迫的應激響應,發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵中兩菌胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平均在18 h大幅度提高,隨后逐漸降低;混菌發(fā)酵過程中胞外總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、過氧化氫酶活力(catalase,CAT)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)均逐漸升高;對兩菌抗氧化相關基因表達的分析發(fā)現(xiàn),B.endophyticus ST-1直接清除ROS的酶基因sodA和katE表達量升高,與氧化還原狀態(tài)相關基因gp和zwf表達升高,K.vulgare25B-1基因grxC、gor、sodB和zwf表達上調;這些結果說明,在混菌發(fā)酵中,B.endophyticus ST-1促進了K.vulgare 25B-1的生長和產酸,由于代謝能力增強導致細胞內ROS的積累,引發(fā)自身氧化脅迫,并通過某些信號分子將這種信號傳遞給B.endophyticus ST-1,B.endophyticus ST-1感受到這種信號,調控一系列與抗氧化和調節(jié)胞內氧化還原環(huán)境相關基因的表達和活性物質的產生。同時K.vulgare 25B-1也促進了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,B.endophyticus ST-1芽孢釋放母細胞裂解,將胞內液釋放到混菌發(fā)酵體系中,不僅為K.vulgare 25B-1提供了營養(yǎng)因子,同時也為其提供了良好的氧化還原環(huán)境,提高了K.vulgare 25B-1抗氧化能力。對不同混菌發(fā)酵體系伴生菌蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn),伴生菌B.pumilus A9與B.endophyticus ST-1均可以促進K.vulgare 25B-1的生長,B.pumilus A9的伴生能力更好,Pearson相關系數(shù)分析顯示兩個發(fā)酵體系的ORP與2-KLG產量均在0.01水平上顯著負相關。Bacillus蛋白組分析顯示,在不同伴生菌的混菌發(fā)酵體系中,B.pumilus A9比B.endophyticus ST-1糖代謝能力更強,為細胞提供了更多的能量和還原力,為產酸菌提供了更充足的中間代謝產物;在氨基酸生物合成通路中,B.pumilus A9與B.endophyticus ST-1相比促進了甘氨酸和絲氨酸間的相互轉化,及蘇氨酸的合成,增強了谷氨酸的合成并轉化成谷氨酰胺。對Bacillus共有差異蛋白的生物信息學分析顯示,B.pumilus A9與K.vulgare 25B-1更能很好的配合,可以同時利用兩種途徑進行糖代謝,代謝能力較強;在核糖體蛋白通路中,伴生菌B.pumilus A9與溫度相關的大亞基核糖體蛋白L6、L22和L23表達的上調;同時發(fā)現(xiàn),B.pumilus A9具有更好的抗氧化能力,對發(fā)酵體系氧化還原平衡的調節(jié)能力更強。對不同混菌發(fā)酵體系產酸菌K.vulgare 25B-1蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn),伴生能力強的B.pumilus A9促進了K.vulgare 25B-1的三羧酸循環(huán)(TCA)和丙酮酸的代謝,并促進了多種氨基酸的合成代謝,有利于蛋白質的合成,代謝能力的增強。在維生素和輔因子代謝通路中,與維生素B_6代謝相關的酶5'磷酸吡哆胺氧化酶表達的上調,促進了吡哆醇的生成,有利于氨基酸的轉氨、脫羧和含硫氨基酸的脫硫。在葉酸一碳單位通路中,相關酶表達的上調,增強了一碳單位的通量,為菌體生長提供必要物質基礎。肽聚糖合成相關的酶表達的上調,說明B.pumilus A9更有利于產酸菌肽聚糖的合成和細胞壁的形成。在K.vulgare 25B-1中,只發(fā)現(xiàn)了兩個與氧化應激相關的蛋白,分別是鐵超氧化物歧化酶和受Spx調控的硫氧還蛋白還原酶,這兩個蛋白的表達均呈現(xiàn)上調的趨勢,可見產酸菌在伴生菌B.pumilus A9的伴生條件下清除活性氧的能力得到了提高,同時調控硫醇平衡的能力也得到了增強,消除了環(huán)境中不利于細胞生長因素,促進了產酸菌的生長代謝。本文通過對Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1單菌及Vc混菌發(fā)酵體系的生理特性、產酸菌產酸酶系基因表達和酶活變化及單菌和混菌發(fā)酵體系抗氧化酶活性和基因表達的分析,闡明了伴生菌解除產酸菌氧化脅迫的分子機制;通過對不同發(fā)酵體系兩菌的蛋白組進行分析,揭示了糖代謝能力和抗氧化能力強的伴生菌,具有更好的伴生效果。
【學位單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

論文研究框架

計算 DPA 濃度。與分析發(fā)酵體系中菌體的生長曲線菌體 OD（optical density）值的變化可反映菌體的生長狀態(tài)，hyticus ST-1 和 K. vulgare 25B-1 的 OD650如圖 2-1 所示�；炀l(fā)酵體濃度高于單菌發(fā)酵中 K. vulgare 25B-1 的菌體濃度，在 24 h 25B-1 的菌體濃度為單菌發(fā)酵的 6 倍，隨后呈下降趨勢，這表明vulgare 25B-1 的生長，在混菌發(fā)酵中 K. vulgare 25B-1 的生長在 漸進入衰亡期；在 0 h - 35 h 期間，混菌發(fā)酵中 B. endophyticu菌發(fā)酵，可見 K. vulgare 25B-1 促進了 B. endophyticus ST-1 的endophyticus ST-1 的生長為單菌發(fā)酵時的 4.6 倍，而在 35 h 后混us ST-1 的菌體濃度低于單菌發(fā)酵，說明其生長受到了抑制。

圖 2-2 不同發(fā)酵體系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量變化（A）DPA 含量標準曲線 （B）不同發(fā)酵體系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量變化Figure 2-2 Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in different fermentation systems(A) The standard curve of DPA concentration (B) Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in differentfermentation systems2.3.3 不同發(fā)酵體系 pH 變化
【參考文獻】

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本文編號：2888193