發(fā)布時(shí)間：2020-10-24 20:48

　　 菜籽粕是壓榨生產(chǎn)菜籽油的副產(chǎn)物,富含優(yōu)質(zhì)的植物蛋白,其水解產(chǎn)物菜籽多肽具有抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及降血壓等功效。目前,菜籽多肽的制備一般使用蛋白酶水解或中溫微生物發(fā)酵法,但是,酶制劑價(jià)格昂貴,中溫發(fā)酵需要消耗大量蒸汽資源對(duì)發(fā)酵底物與設(shè)備進(jìn)行徹底滅菌,同時(shí)菜籽蛋白經(jīng)高溫高壓滅菌易變性,在一定程度上影響了菜籽蛋白的轉(zhuǎn)化效率。利用高溫蛋白酶產(chǎn)生菌對(duì)菜籽粕高溫固態(tài)發(fā)酵,能有效抑制發(fā)酵基質(zhì)中嗜溫污染微生物的生長(zhǎng),可實(shí)現(xiàn)不滅菌底物直接發(fā)酵,大幅度降低成本,同時(shí)增加底物利用率、提高菜籽多肽產(chǎn)量。本論文首先從菜籽粕中篩選出能高效水解菜籽蛋白的高溫菌,通過對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析,以驗(yàn)證高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的可行性;采用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變篩出菌以提高蛋白酶活力,并利用響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的工藝參數(shù);最后運(yùn)用基因組重測(cè)序技術(shù)初步探究ARTP誘變出發(fā)菌高產(chǎn)高溫蛋白酶潛在機(jī)制。本文的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)通過比較高溫與中溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕底物中菌落總數(shù)的差異,初步探究高溫發(fā)酵的可行性,結(jié)果表明高溫發(fā)酵可顯著減少基質(zhì)中嗜溫微生物的生物量。采用水解圈初篩與蛋白酶活力復(fù)篩的方法,成功從菜籽粕中篩選出一株產(chǎn)高溫蛋白酶菌株,命名為RM-2,其蛋白酶活力可達(dá)25.50 U/mL,經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序,表明菌株RM-2屬于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)。(2)利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同條件固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕基質(zhì)中的細(xì)菌群落組成與豐度,進(jìn)一步驗(yàn)證高溫發(fā)酵的可行性,并確定發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種。Alpha-多樣性分析結(jié)果顯示,高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕相比中溫發(fā)酵,基質(zhì)中的操作歸類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)減少了37.5%,且高溫發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌種為土(地)芽孢桿菌屬(Geobacillus),其相對(duì)豐度為72.83%;經(jīng)Beta-多樣性分析,組間樣本存在較大差異,對(duì)高溫發(fā)酵組產(chǎn)生顯著性影響的物種為地芽孢桿菌屬(Geobacillus)。(3)以嗜熱脂肪地芽孢桿菌為出發(fā)菌,利用常壓室溫等離子體進(jìn)行誘變,篩選出高產(chǎn)高溫蛋白酶突變菌。結(jié)果表明,在通氣量為10 SLM(標(biāo)況下升每分鐘,Standard Litre per Minute)、功率為100 W、誘變時(shí)間為5 s的條件下,ARTP誘變致死率可達(dá)90.5%,并在此條件下以水解圈直徑與菌落直徑之比(K值)為初篩指標(biāo)、蛋白酶活力為復(fù)篩指標(biāo),篩選出一株產(chǎn)酶活力較高且能穩(wěn)定遺傳的突變菌株A75,其蛋白酶活力達(dá)到32.09 U/mL,相對(duì)于出發(fā)菌株提高了25.62%。(4)通過響應(yīng)面法優(yōu)化了突變菌株A75高溫固態(tài)發(fā)酵未滅菌菜籽粕制備多肽的工藝參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在每20 g不含水發(fā)酵基質(zhì)中接種10~7 CFU菌量、發(fā)酵時(shí)間65 h、料液比1:1.6(g/mL)、發(fā)酵溫度55℃、麩皮添加量20%(W/W)、MgSO_4添加量0.1%(W/W)的條件下,菜籽多肽得率達(dá)到最大值6.78%,且小分子蛋白組分與總氨基酸含量較未發(fā)酵組均有所提高,分別提高了15.17%和16.47%。(5)初步探究ARTP誘變嗜熱脂肪地芽孢桿菌機(jī)制。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)相對(duì)于出發(fā)菌株RM-2,突變菌株A75的菌體變?yōu)槎虠U狀;利用基因組重測(cè)序技術(shù),發(fā)現(xiàn)突變菌株A75共發(fā)生了343處單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)非同義突變位點(diǎn),涉及的基因有121個(gè),將差異基因編碼的氨基酸序列分別在GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)有較多的差異基因參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物的代謝、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的組成以及氮化合物的代謝等過程中,說明ARTP誘變儀處理嗜熱脂肪地芽孢桿菌時(shí),活性粒子可能穿透了細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化,從而影響了菌體蛋白酶的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ920.1;TS229
【部分圖文】：

呈革蘭氏陽(yáng)性且菌體為桿狀，結(jié)果如圖2.3（b）所示。（2）篩出菌 16S rRNA 鑒定結(jié)果圖 2.4 篩選菌株 RM-2 瓊脂糖凝膠電泳條帶Fig. 2.4 Agarose gel electrophoresis strip of screening strain RM-2(b)

2.3 菌株 RM-2 菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)ny morphology and Gram staining results 的篩出菌 RM-2 進(jìn)行適當(dāng)稀釋，并吸上以觀察菌落形態(tài)，結(jié)果表明 RM-狀且邊緣清晰，如圖 2.3（a）所示10×100）下觀察，呈革蘭氏陽(yáng)性且 rRNA 鑒定結(jié)果

圖 3.2 發(fā)酵基質(zhì)樣本的稀釋性曲線Fig. 3.2 Rarefaction curves of fermentation substrate samples如圖3.2所示，對(duì)照組隨著測(cè)序深度的加大，觀測(cè)到的OTU數(shù)目迅速增加，并且顯著大于其他三組樣本中的 OTU 數(shù)目，這與 Alpha-多樣性指數(shù)分析的結(jié)果一致。當(dāng)測(cè)序深度繼續(xù)加深時(shí)，四個(gè)樣本的稀釋性曲線都趨于平緩，說明此次測(cè)序已達(dá)到飽和，測(cè)得的數(shù)據(jù)量足以代表樣本中的全部物種信息，無需增加測(cè)序量，進(jìn)一步表明此次高通量測(cè)序數(shù)據(jù)足以分析不同條件固態(tài)發(fā)酵菜籽粕對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。3.4.5 發(fā)酵基質(zhì)樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析為了更深一步獲得不同條件固態(tài)發(fā)酵菜籽粕對(duì)發(fā)酵基質(zhì)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的具體信息，首先從科分類水平上了解樣本內(nèi)的物種組成，選取豐度在前 20的物種進(jìn)行分析
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本文編號(hào)：2854961