發(fā)布時(shí)間：2020-10-23 17:49

　　 具有酯化活性的脂肪酶在化妝品行業(yè)、生物柴油、食品行業(yè)和精細(xì)化工等酶法制造中具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。為了滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)的需求,尋找酯化活性脂肪酶為工業(yè)生產(chǎn)所急需。本文克隆了黑曲霉脂肪酶基因并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá),進(jìn)一步解析其酶學(xué)性質(zhì)及其酯化活性。獲得如下主要結(jié)果:從黑曲霉F0215中,成功擴(kuò)增脂肪酶基因tglE,大小為801bp,編碼266個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為28kDa。通過(guò)模擬蛋白結(jié)構(gòu)分析,Ser139、Asp195、His248為其催化中心氨基酸殘基組成;成功構(gòu)建了重組畢赤酵母菌株GS115-tglE;搖瓶水平上,TglE的發(fā)酵液酶活達(dá)到32.88 U/mL;進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵制備酶液并進(jìn)行純化,經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、PD-10除鹽、凝膠柱層析純化,聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,分子量大小約為32 kDa,比酶活為137.08 U/mg,純化倍數(shù)為13.95,得率為13.36%。對(duì)純化后的脂肪酶TglE進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析表明,脂肪酶的最適作用溫度為40℃,最適作用pH為7.0,在20-30℃和pH6.0-8.0條件下具有良好的穩(wěn)定性;Cu2+、Mrn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Sn2+、二甲基亞砜、甲醇和庚烷對(duì)脂肪酶TglE的水解活性有促進(jìn)作用,Ca2+和庚烷的促進(jìn)作用較明顯;Fe3+、Zn2+、EDTA、乙酸甲酯和十二烷對(duì)脂肪酶TglE的活性有抑制作用,其中金屬離子螯合劑EDTA和十二烷的抑制作用較明顯;脂肪酶對(duì)C4底物的作用最強(qiáng),對(duì)C16底物的作用最弱,為以C4為底物的30.96%;它對(duì)橄欖油的作用最強(qiáng),對(duì)棕果油的作用最弱,為以橄欖油為底物的45.45%;動(dòng)力學(xué)常數(shù)的研究表明,脂肪酶TglE的Km值為14.40 mmol/L,V/Lx為46.72 mmol/(L·h)。確認(rèn)了脂肪酶TglE具有酯化活性。通過(guò)氣相色譜分析,脂肪酶在以十二烷為溶劑,反應(yīng)體系中酸濃度為0.3 mol/L,辛酸與乙醇摩爾比為1:2.4的條件下,12 h催化辛酸和乙醇酯化的轉(zhuǎn)化率為36.84%。本文成功將黑曲霉脂肪酶基因在畢赤酵母中克隆表達(dá),系統(tǒng)研究了其酶學(xué)性質(zhì)及酯化活性,為其在工業(yè)中應(yīng)用做出初步探索。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：TQ925.6
【部分圖文】：

，。濃度測(cè)定方５去??ＣＡ蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），按照試酶酶活測(cè)定方法??標(biāo)堿滴定法??標(biāo)?ＧＢ／Ｔ?２３５３５－２００９１８５】??義：１?ｇ固體酶粉（或１?ｍＬ液體酶），在一定溫度和ｐＨ條件，叩１〇１的可滴定的脂肪酸，即為１個(gè)酶活力單位，以Ｕ／ｇ（Ｕ／ｍＬ）硝基苯酚法??獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶酶活方法如下［８６１：??曲線繪制??０１?ｍＭ、０．０２?ｍＭ、０．０３?ｍＭ、０．０４?ｍＭ、０．０６?ｍＭ、０．０８?ｍＭ?的，分別在４１０?ｎｍ下測(cè)定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下圖。??

根據(jù)網(wǎng)上注釋信息，這沉基因序列全長(zhǎng)為８６１?ｂｐ，編碼氨基酸個(gè)數(shù)為２８６個(gè)。在??丹麥技術(shù)大學(xué)生物序列分析中心（ＣＢＳ?）的網(wǎng)站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ?），??通過(guò)ＳｉｇｎａｌＰ平臺(tái)對(duì)其編碼的氨基酸序列信號(hào)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖３－１。從??信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)看，這沉基因編碼的氨基酸序列的Ｎ末端包含一個(gè)典型的信號(hào)肽序??列（ｌ－２０ａｖ），信號(hào)肽切割位點(diǎn)為：ＬＡＶ－ＰＭ。設(shè)計(jì)引物時(shí)去除編碼信號(hào)肽的序列。??９ｇｎａｌＰ－４?１?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?（ｅｕｋ?ｎｅｔｗｏｒｋｓ）?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??￣?Ｇｓｃｏｒｅ＇??１?０?Ｓｓｃｏｒｅ???？??Ｙ－ｓｃｏｒｅ????０?８??，．?ｊ?：??１。４．—一．??０?２?？??ａ。川丨丨｜丨丨｜丨丨丨丨丨丨丨｜｜丨｜?ｉｉｉｉｉｉｉ?ｉｌｍｎｉｉｆｆｌｉｎＭＭｉｉ??ＭＲＶＧＫＳＴ?ＬＦＧＧＬＡＬＴ?ＰＩＴ?ＵＶ?ＭＨＯＳＲＡＴＳＯＰＡＥＷＴ?ＥＬＨＲＡＡＯｌＳＳＡＡ?ＹＴＱＣＴ６ＳＡ?ＦＤＶＴ?ＩＴ?ＫＯＩ?ＩＩＥＩＶ１??０?１０?２０?３０?４０?５０?６０?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??圖３－１吃／￡蛋白信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)結(jié)果??Ｆｉｇ．?３－１?Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｌｇＥ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．２脂肪酶基因這／￡的克隆??３．２．１?Ａｓ＾ｅｒｇ７’／／ｕｓ?廠?Ｆ０２１５?總?ＲＮＡ?的提取??按照２．２．２．１中方法提取黑曲霉Ｆ０２１５總ＲＮＡ

１?２??ＥＳＫ３—１８Ｓ??圖３－２黑曲霉Ｆ０２１５總ＲＮＡ電泳結(jié)果??Ｆｉｇ．?３－２?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｏｆ?Ａ．?ｎｉｇｅｒ?Ｆ０２１５??１，２均為黑曲霉總ＲＮＡ??３．２．２脂肪酶基因這／￡的擴(kuò)增??以黑曲霉總ＲＮＡ為模板，反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)??進(jìn)行。合成的ｃＮＤＡ適當(dāng)稀釋后作為模板，按照２．２．５中方法，通過(guò)ＰＣＲ反應(yīng)，對(duì)目??的基因戌／￡進(jìn)行擴(kuò)增。ＰＣＲ產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖３－３所示，大小約為０．８?ｋｂ，無(wú)其它雜??帶，黑曲霉脂肪酶基因故／￡預(yù)期大小為８０１?ｂｐ，與電泳結(jié)果相吻合，可以進(jìn)行載體構(gòu)??建，并測(cè)序。??Ｍ?１??１?Ｋｂ——■鑛＿??０．７５?Ｋｂ——ｊ??圖３－３目的基因／ｇ／Ｅ?ＰＣＲ電泳結(jié)果??Ｆｉｇ．?３－３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅｓ?ｔｇｌＥ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?１：目的基因?
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