發(fā)布時間：2020-11-09 14:04

　　 玉米象是一種世界性倉儲害蟲,每年因玉米象的危害給人類造成重大的經(jīng)濟損失。目前市場上熏蒸劑如磷化氫、硫酰氟、溴甲烷等在玉米象的防治中發(fā)揮了巨大作用,但由于此類藥劑長期大量不科學(xué)使用,導(dǎo)致玉米象產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性,同時也加劇了對高等生物和大氣環(huán)境的安全風(fēng)險,限制了它們在儲糧害蟲防治上與管理中的持久應(yīng)用。辣根素(AITC)是一種從植物中提取的異硫氰酸酯類化合物,具有植物源殺蟲劑安全、低殘留等優(yōu)點,并對倉儲害蟲具有較好的熏蒸殺蟲效果,被認(rèn)為是一種潛在的植物源熏蒸劑。目前關(guān)于AITC殺蟲機理尚無定論,明確AITC對倉儲害蟲的作用機制,有助于指導(dǎo)AITC高效、科學(xué)、合理使用。本研究以玉米象成蟲為研究對象,在課題組前期研究基礎(chǔ)上從基因克隆、載體構(gòu)建與表達(dá)分析、蛋白純化、同源建模與分子對接等幾個方面開展試驗工作,探索AITC對玉米象線粒體細(xì)胞色素c氧化酶(COX)核心亞基作用影響,研究取得的主要結(jié)果如下:1、玉米象成蟲線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ基因克隆與序列分析。通過改進后的CTAB法提取玉米象成蟲總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,結(jié)合RACE和RT-PCR策略克隆獲得玉米象線粒體COXⅡ/Ⅲ的開放閱讀框(ORF),并獲得了COXⅡ登錄號:GenBank KX783028。生物信息學(xué)分析表明,COXⅠ基因的ORF為1542 bp,編碼513氨基酸(amino acid,aa),蛋白分子量(Molecular weight,Mw)為57061.12,理論等電點(Isoelectric point,pI)為6.33,起始密碼子為AUU,終止密碼子為UAA;COXⅡ基因的ORF為684 bp,編碼227 aa,Mw為26237.88,pI為6.37,起始密碼子為AUA,終止密碼子為UAA;COXⅢ的ORF為792bp,編碼263 aa,Mw為30938.1,pI為6.51,起始密碼子為AUG,終止密碼子為UAA。2、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ載體構(gòu)建與原核表達(dá)。對COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ三個核心亞基基因均構(gòu)建了pET系列載體(pET28a、pET30a、pET32a、pET42a)和pEASYBlunt E1重組體,并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中。誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot(WB)驗證,只有pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)、pET32-COXⅢ-E.coli BL21(DE3)得以表達(dá),融合蛋白分子量分別為44kD和62kD,其中COXⅢ主要以包涵體形式存在,COXⅡ以可溶性形式存在上清液中。試驗對pET42-COXⅡ-E.coli BL21(DE3)可溶性條件進行了優(yōu)化,結(jié)果顯示在溫度16℃、IPTG為1 mmol L~(-1)、轉(zhuǎn)速180rpm,誘導(dǎo)24h后上清液中COXⅡ含量最高,并通過Ni+-NTA柱對COXⅡ進行蛋白純化以及濃度測定,測得COXⅡ蛋白濃度為50μg/mL。3、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ在畢赤酵母GS115中的嘗試表達(dá)。PP5軟件設(shè)計含有EcoR I和Kpn I酶切位點的引物,經(jīng)克隆、酶切、連接等構(gòu)建了pPICZα-COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ重組表達(dá)載體,經(jīng)雙酶切和測序后,基因序列正確,無突變發(fā)生。用線性化酶Sac I對上述三個重組體進行線性化后,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞,成功構(gòu)建轉(zhuǎn)化子。4、玉米象線粒體核心亞基COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ同源建模與分子對接。利用UV/Vis光譜分析了AITC對COXⅡ蛋白活性的影響,試驗結(jié)果顯示原核表達(dá)產(chǎn)物COXⅡ具有一定酶活,但活性較弱;結(jié)合IR光譜分析結(jié)果,證實AITC可能與COXⅡ蛋白在N-端或C-端發(fā)生了結(jié)合,致使波數(shù)發(fā)生了藍(lán)移。研究選取與COXⅠ(同源率75%)、COXⅡ(同源率60%)、COXⅢ(同源率59%)同源率較高的蛋白牛心細(xì)胞色素C氧化酶(PDB ID:1V54)為模板,采用modeller 9.17軟件對COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ進行三維結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建�；�于Autodock vina 1.1模擬平臺,將AITC與COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ進行對接,結(jié)果表明AITC均可與三個亞基發(fā)生結(jié)合,其中AITC中的烯丙基位于COXⅠ氨基酸殘基Phe-20、Ile-73、Ile-389、Ile-390、Phe-393和Phe-468組成的疏水性口袋中,AITC中硫原子與Gly-27形成鍵長為3.3?的氫鍵相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅡ氨基酸殘基Ile-34、Pro-69、Ile-72和Leu-73所組成的疏水性口袋中,AITC中硫原子與Leu-31形成鍵長為3.4?的氫鍵相互作用;AITC中的烯丙基位于COXⅢ氨基酸殘基Ile-63、Leu-81、Phe-235和Gly-236組成的疏水性口袋中,AITC中硫原子與Arg-223形成鍵長為2.8?的氫鍵相互作用。綜合分析蛋白疏水性、氫鍵相互作用、范德華力等因素,AITC與COXⅠ/Ⅱ/Ⅲ親和力分別為-3.4 kcal/mol、-3.0 kcal/mol和-3.2 kcal/mol,故AITC對核心亞基的抑制活性順序:COXⅠCOXⅢCOXⅡ。這與課題組前期利用RNAi技術(shù),研究AITC對玉米象的作用結(jié)果相似,均對COXⅠ表現(xiàn)出較強的抑制效果。綜上所述,本論文對玉米象三個核心亞基進行了基因克隆與生物信息學(xué)分析,獲得玉米象COXⅡ/Ⅲ完整的開放閱讀框,在此基礎(chǔ)上,利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對三個核心亞基進行了載體構(gòu)建和嘗試表達(dá),SDS-PAGE和WB驗證結(jié)果表明,只有COXⅡ以可溶性蛋白形式在原核體系中表達(dá)成功。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件,對純化后的COXⅡ蛋白進行了濃度分析和活性測定。最后,通過同源建模和分子對接,構(gòu)建了三個核心亞基的三維結(jié)構(gòu)模型,分析了與AITC相互作用位點。以上工作一方面為AITC對倉儲害蟲熏蒸作用機理深入研究奠定基礎(chǔ),另一方面為AITC類化合物的生物合理設(shè)計與合成提供參考。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S379.5
【部分圖文】：

圖 1-1 AITC對玉米象線粒體作用機理（張超 2016）Fig. 1-1 Effect of AITC on mitochondria of Sitophilus zeamais在的作用靶標(biāo)

圖 1-2 異硫氰酸酯類化合物潛在的作用靶標(biāo)（Mi et al .2008）Fig.1-2 Protential major protein targers of ITCs期我們研究了 AITC 對玉米象的熏蒸致毒作用機理，研究結(jié)果表明，處理的玉米象成蟲，其線粒體嚴(yán)重變形，內(nèi)嵴稀少，集中密度降低，更部空泡化(Wu et al. 2014)。與此同時，AITC 對玉米象體內(nèi) CAT、GST

圖 2-1 玉米象成蟲總 RNA 提取結(jié)果. 2-1 The total RNA extracted from adult S. zeamaM:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000; L:總 RNAM:DNA Marker DL2000; L:The total RNA閱讀框的擴增及序列分析放閱讀框的擴增DNA 為模板，通過特異性引物 cox1-2F/ 2000bp 處有一條亮帶，經(jīng)測序，該條帶6508）基因序列相似度為 99%。
【參考文獻】

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本文編號：2876537