發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 13:15

　　 肝癌嚴(yán)重威脅著人類健康乃至生命。目前,癌癥的主要治療手段如外科手術(shù)、放療及化療等都存在著局限性和不確定性�；�因治療技術(shù)的出現(xiàn)為癌癥的治療展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。基因治療過程中所用到的載體主要有兩種:病毒載體和非病毒載體。前者具有很高的轉(zhuǎn)染效率,但它們可能會引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)甚或發(fā)生基因整合而再次引發(fā)細(xì)胞癌變,極大的限制了它們在臨床上的應(yīng)用。而后者具有較高的生物安全性,但存在轉(zhuǎn)染效率低下的問題。近年來,研究者們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌磁小體(Bacterial magnetic particle,BMP)是一個(gè)優(yōu)良的基因轉(zhuǎn)移載體,它不僅有較高的基因轉(zhuǎn)移效率,而且具有生物相容性和生物安全性等優(yōu)點(diǎn),為其應(yīng)用于基因治療奠定了基礎(chǔ)。本研究將凋亡素(Chicken anemia virus protein 3,VP3)-天蠶素(Antibacterial peptides,ABPs)基因克隆到基因治療的真核載體pVAX1中(BMP-pVAX1-VP3-ABPs,pVAX1-VA),在細(xì)胞水平和機(jī)體水平研究以BMP作為基因轉(zhuǎn)移載體在肝癌基因治療中的可行性,并研究共表達(dá)VP3-ABPs的目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA對人類肝癌治療的有效性和安全性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,本研究首先確定BMP-DNA復(fù)合物的連接體系,證明以濃度為2mg/mL的PEI作為偶聯(lián)劑,BMP、PEI和DNA質(zhì)量比為1:1.6:0.8時(shí)制備的BMP-DNA復(fù)合物具有最佳的基因轉(zhuǎn)染效率。通過透射電鏡、zeta電位和水合粒徑等分析BMP-DNA復(fù)合物,結(jié)果顯示BMP連接目的基因前、后在大小、形狀等方面沒有明顯改變,可以有效的遞送并保證目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。其次,本研究探索了以BMP作為基因載體攜帶含有綠色熒光蛋白的目的基因表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP3-ABPs(pIRES2-VA)在人的腫瘤細(xì)胞HepG2、HeLa以及人的正常肝細(xì)胞HL7702中的基因遞送效率,結(jié)果顯示相比于PEI和Lipofectamine 2000,BMP具有更高的基因轉(zhuǎn)染效率,且在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率顯著高于正常細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),以BMP為載體遞送目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA對癌細(xì)胞具有一定的選擇性殺傷作用。隨后,本研究分析了共表達(dá)VP3和ABPs的目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA在HepG2和HL7702細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。Hochest33342、annexin-V/7-AAD、細(xì)胞周期、細(xì)胞線粒體膜電位以及caspase家族基因等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于Lipofectamine2000,以BMP作為基因載體攜帶目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA進(jìn)入HepG2細(xì)胞后,會進(jìn)一步降低細(xì)胞線粒體膜電位、上調(diào)caspase-3和caspase-9的表達(dá)而顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而且,與單獨(dú)表達(dá)VP3或ABPs基因相比,共表達(dá)VP3-ABPs基因顯著提高了其作用效果。此外,目的基因?qū)φ�常�?xì)胞的作用效果不明顯,也表明以BMP作為基因載體攜帶目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA可以選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。最后,本研究構(gòu)建了 BALB/c雌性裸鼠皮下腫瘤模型,以BMP作為基因載體攜帶目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA,并在治療劑量分別為1、3、5、10和20 μg時(shí)檢測目的基因在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果顯示pVAX1-VA在體內(nèi)可以有效的抑制腫瘤生長,在劑量為5 μg時(shí)治療效果最明顯,抑瘤率可達(dá)51%,更高劑量的治療效果未明顯提高。此外,以BMP作為基因載體遞送目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA的抗腫瘤效果比以Lipofectamine2000為載體是顯著提高。對小鼠腫瘤和主要組織器官進(jìn)行HE染色,觀察到BMP-pVAX1-VA治療組小鼠的腫瘤組織周圍有大量的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞,而心、肝、脾、肺和腎等主要器官沒有顯示出明顯的組織病變。表明以BMP為載體在體內(nèi)遞送目的基因表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA具有良好的抗腫瘤效果,且對機(jī)體主要臟器毒副作用較小。綜上所述,BMP是一種高效且相對安全的基因傳遞載體,并首次在細(xì)胞和機(jī)體水平上證實(shí),以BMP為載體攜帶共表達(dá)VP3和ABPs基因的表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-VA對肝癌具有良好的治療效果,且其比單獨(dú)表達(dá)VP3或ABPs基因時(shí)具有更高的療效。為惡性腫瘤的基因治療提供了新的理論依據(jù)和技術(shù)手段。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7;R450
【部分圖文】：

組中存在一類處于靜息狀態(tài)的基因，被稱為原癌基因，這類基因起重要的調(diào)控作用。在致癌因素的影響下，原癌基因的結(jié)構(gòu)和為促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的癌基因（Ａｇａｔｈａｎｇｇｅｌｏｕｅｔａｌ．，?２００５），從有一類與原癌基因相對的，對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用的基因，會抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)受損細(xì)胞發(fā)生凋亡，如果抑癌基因的功轉(zhuǎn)化（Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．，２０１６）。??們認(rèn)為癌細(xì)胞是由體細(xì)胞發(fā)生突變而來，但隨著腫瘤發(fā)生的分子現(xiàn)了大量有悖于體細(xì)胞突變學(xué)說的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即并非所有腫瘤能是由干細(xì)胞或者造血祖細(xì)胞這類具有很強(qiáng)增殖和分化能力表型的改變（Ｄｏｎｔｕ?ｅｔ?ａｌ．，?２００３）。諸多證據(jù)表明，人類癌癥的發(fā)由于機(jī)體基因的改變，使正常的細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為高度惡性的癌基因與抑癌基因致癌突變的積累。研究者對多種類型的癌癥中有多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變，這與達(dá)爾文進(jìn)化論過程類似，在這的基因變化，而每一種變化都會賦予細(xì)胞一種生長優(yōu)勢，從而促（Ｈａｎａｈａｎ?ａｎｄ?Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，?２０１１）。??

的目的仍是基因治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。??１．３．２基因治療中的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)??外源基因的轉(zhuǎn)移通常有五個(gè)步驟（圖１－４）：〗）外源基因與細(xì)胞膜接觸；２）細(xì)胞通過內(nèi)??吞作用將外源基因吞入進(jìn)入溶酶體；３）外源基因從溶酶體中出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；４）外源基因??進(jìn)入細(xì)胞核；５）外源基因在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，發(fā)揮免疫學(xué)功能（ＷａｇｎｅｒａｎｄＫｌ〇ｅｃｋｎｅｒ，２００６ｈ??一個(gè)有效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)決定了遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的效率和持續(xù)發(fā)揮治療作用的時(shí)間，也??是所有基因治療的基礎(chǔ)。??／〇＼?Ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ??＇?＇?ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ??一??Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ?＾??ｉ?ｒ＼（３）??⑥名）少＇：＿（５廠：：乂＇吵??Ｃ＾ｏｓｏｌ?／／?Ｎｕｃｌｅｕｓ?ｕｎｐｏｒｔ?＼＼??圖１￣４．外源基因轉(zhuǎn)染示意圖（Ｗａｇｎｅｒ?ａｎｄ?Ｋｌｏｅｃｋｎｅｒ，?２００６）??外源基因轉(zhuǎn)移的五個(gè)步驟：１）外源基因與細(xì)胞膜接觸；２）細(xì)胞通過內(nèi)吞作用將外源基因吞入進(jìn)入溶酶體；??３）外源基因從溶酶體中出來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；句外源基因進(jìn)入細(xì)胞核；５）外源基因在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，發(fā)揮免疫??學(xué)功能。??目前，基因轉(zhuǎn)移的載體可分為兩類：病毒和非病毒。病毒載體，是通過改造病毒的基因??組，使其攜帶外源基因并包裝成完整的病毒顆粒。這類載體以病毒感染的方式將基因傳遞到??細(xì)胞內(nèi)部，轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率都較高。但是，病毒載體在構(gòu)建和純化方面比較困難，而且存在??如包裝容量有限、插入突變、基因重組及免疫反應(yīng)等一系列安全隱患。因此

能檢測到ＦｅＳ和ＦｅＳ２的存在（Ｂａｚｙｌｉｎｓｋｉ?ｅｔ?ａｌ．，１９９５）。每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)約有１０－３０個(gè)成熟的??磁小體，直徑在３５－１２０?ｎｍ之間，處于穩(wěn)定的單磁疇晶體范圍內(nèi)（Ｂａｚｙｌｉｎｓｋｉｅｔａｌ．，１９９４）。晶??體的形態(tài)結(jié)構(gòu)主要有棱柱形、正八面體形、子彈狀、液滴狀、薄片狀以及球狀等（圖１－９）。??２０??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王毅剛;何凌峰;何國清;孔彥平;劉旭平;蔡海波;劉新垣;譚文松;;腫瘤靶向腺相關(guān)病毒攜帶干擾素β和TRAIL對A549肺癌移植瘤的增強(qiáng)治療效應(yīng)(英文)[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年06期

2 ;Antitumor Effect of a Novel Adeno-associated Virus Vector Targeting to Telomerase Activity in Tumor Cells[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄧宏;中醫(yī)藥綜合治療中晚期肝癌的療效及預(yù)后因子分析[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 陳璐;中藥外治法在常見惡性腫瘤及其并發(fā)癥中的應(yīng)用研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 王春暉;VP3與改良型TAT-VP3基因的真核表達(dá)及誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2007年

3 張利芳;抗菌肽ABPS1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在腫瘤基因治療中的初步應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

本文編號：2893054