發(fā)布時間：2018-01-08 01:19

  本文關鍵詞：乳酸桿菌制劑對膿毒癥小鼠的保護作用及其腸道微生態(tài)與血清、糞便代謝組學研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究背景:膿毒癥及其并發(fā)癥是重癥監(jiān)護病房(ICU)患者常見死亡原因之一。老年患者因免疫力低下、器官功能減退,發(fā)生膿毒癥后的預后更不容樂觀。研究顯示,膿毒癥患者常伴隨腸道微生態(tài)失衡。而膿毒癥所致腸上皮細胞功能紊亂、腸道菌群失調(diào)引起的致病菌過度生長及腸菌易位又將進一步加重膿毒癥的發(fā)展。益生菌乳酸桿菌,通過平衡腸道菌群、調(diào)節(jié)腸道屏障功能以及增強宿主免疫對宿主起保護作用。臨床研究表明乳酸菌菌株、測試劑量、攝入方式等因素不同對疾病(例如:腹瀉、過敏性疾病、炎癥性腸病等)的療效有很大影響。此外,多數(shù)研究的重點僅在于評價乳酸桿菌對疾病的防治效果,少有嘗試解釋這些微生物益生作用的精確機制。本研究旨在探討鼠李糖乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)制劑對小鼠膿毒癥發(fā)生發(fā)展的影響,并從乳酸桿菌對腸道屏障功能、腸道菌群及代謝調(diào)節(jié)的影響三個方面闡述可能的機制。為益生菌能否作為膿毒癥患者常規(guī)治療用藥之一提供詳實的臨床前研究數(shù)據(jù)。第一部分乳酸桿菌制劑對膿毒癥小鼠保護作用的研究目的:觀察LGG對膿毒癥小鼠生存率、細胞炎癥因子、腸菌易位、腸病理學改變等的影響,探討LGG是否對膿毒癥所致腸道屏障功能損傷具有保護作用。方法:采用盲腸結(jié)扎穿刺(Cecal ligation and puncture,CLP)手術構(gòu)建小鼠膿毒癥模型,于造模前分別給予LGG+膿毒癥組小鼠LGG溶液(高、中、低劑量組),對照膿毒癥與假手術組小鼠生理鹽水連續(xù)灌胃4周,觀察其一般情況和7天生存率。以提高生存率最為顯著的LGG劑量作為后續(xù)實驗劑量,于術后24h分別檢測小鼠血清Alb、CRP水平;Elisa檢測血清炎癥因子IL-22、IL-2、TNF-α、IL-6含量;外周血培養(yǎng)檢測菌血癥情況;對小鼠結(jié)腸組織進行HE染色觀察腸壁破壞情況;Ki67免疫組化、TUNEL染色分別檢測結(jié)腸壁細胞增殖、凋亡情況;Occludin蛋白免疫組化檢測結(jié)腸上皮細胞緊密連接狀態(tài)。結(jié)果:(1)LGG治療可顯著提高膿毒癥組小鼠生存率,且與劑量正相關。(2)LGG治療升高血清Alb,降低CRP水平。同時明顯降低血清炎癥因子IL-22、IL-2水平,但對TNF-α與IL-6影響不大。(3)LGG治療顯著減輕膿毒癥小鼠菌血癥程度;明顯改善腸上皮病理形態(tài);增強腸上皮完整性;減少腸上皮炎癥細胞浸潤;促進腸上皮細胞增殖、抑制凋亡;并提高腸上皮細胞緊密連接相關蛋白的表達。結(jié)論:早期使用LGG通過減輕膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥程度,增強腸粘膜屏障完整性與功能,減少腸菌易位降低膿毒癥死亡率。第二部分乳酸桿菌制劑對膿毒癥小鼠腸道微生態(tài)的影響目的:探討LGG對膿毒癥腸道微生態(tài)的影響,并分析小鼠患膿毒癥后腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的特征,為將腸道微生態(tài)作為膿毒癥的生物標志物提供理論依據(jù)。方法:將小鼠隨機分為:LGG+膿毒癥組、對照膿毒癥組和假手術組,重復同前灌胃與CLP手術,術后24h分別取各組小鼠的糞便,通過16SrDNA高通量測序技術分析腸道微生態(tài)多樣性,鑒定與比較不同處理組小鼠腸道菌群的組成及含量差異。結(jié)果:(1)LGG治療顯著提高膿毒癥小鼠腸菌豐度及多樣性。(2)PCoA結(jié)果顯示三組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異。膿毒癥小鼠腸道內(nèi)與能量消耗相關的擬桿菌門細菌;與機會感染相關的變形菌門、葡萄球菌科和腸球菌科細菌;與產(chǎn)LPS相關的致病菌腸桿菌科細菌及兼性厭氧菌如擬桿菌科、Erysipelotrichaceae科細菌比例增加,與能量儲存相關的厚壁門細菌;與維持消化道屏障功能相關的阿克曼菌屬細菌;與保護肝功能相關的糞球菌屬、顫螺菌屬細菌和專性厭氧菌如普雷沃氏菌科細菌比例降低。這些菌群結(jié)構(gòu)改變打破能量平衡、加重炎癥反應、降低腸道屏障功能、促進腸菌易位。LGG干預增加有益菌、降低有害菌比例,使腸道菌群結(jié)構(gòu)正�；�。結(jié)論:LGG早期干預,將使膿毒癥失衡的腸道微生態(tài)重新趨于平衡,對腸道菌群多樣性和有益菌表達均有良性調(diào)節(jié)作用。其中,阿克曼菌、普雷沃氏菌可作為治療膿毒癥的潛在益生菌開發(fā),研究結(jié)果為以調(diào)節(jié)腸道菌群為治療手段治療膿毒癥提供理論依據(jù)。第三部分乳酸桿菌制劑對膿毒癥小鼠血清、糞便代謝組學的影響目的:在代謝水平上對膿毒癥與腸道菌群關系進行深入探索,并分析LGG對膿毒癥代謝的影響。方法:小鼠分組與膿毒癥造模同第二部分,采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS)分別檢測不同處理組小鼠血清及糞便代謝譜,尋找可作為早期診斷膿毒癥發(fā)生及評價LGG早期療效的生物標志物。結(jié)果:(1)采用偏最小二乘法判別分析對三組UPLC/MS數(shù)據(jù)進行代謝模式分析,結(jié)果顯示LGG+膿毒癥、對照膿毒癥和假手術組小鼠代謝譜顯著不同,其中,LGG+膿毒癥與假手術組的距離更為接近。(2)膿毒癥小鼠血清中,磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholines,PCs)表達上調(diào)。含多不飽和脂肪酸的溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholines,LPCs)表達下調(diào),含飽和脂肪酸的LPCs表達與假手術組小鼠無顯著差別。19個血清標志物水平在LGG+膿毒癥與假手術組小鼠間的差別小于對照組膿毒癥與假手術組小鼠。LPCs、花生四烯酸、視黃醇磷酸和二磷脂酰甘油在對照膿毒癥小鼠糞便中表達顯著上調(diào),L-苯丙氨酸片段和部分膽酸明顯下調(diào)。LGG預處理后,多數(shù)糞便代謝物異常消失。結(jié)論:LGG對膿毒癥小鼠血清及糞便中關鍵代謝物具有良性調(diào)節(jié)作用,主要包括脂類/磷脂代謝與膽汁酸代謝途徑相關代謝產(chǎn)物,這些代謝途徑與能量消耗、炎癥反應、氧化應激等相關,腸道菌群失調(diào)與糞便代謝型異常密切相關。LGG能夠通過重新平衡腸道微生態(tài),使膿毒癥小鼠的血清與糞便代謝型正常化。
[Abstract]:Objective : To study the effects of LGG on the development of intestinal barrier function , intestinal flora and metabolic regulation . The aim of this study was to study the effect of LGG on the intestinal barrier function , intestinal flora and metabolic regulation . Objective : To study the effects of LGG on intestinal microecology of septic mice . Objective : To study the effects of LGG on sepsis and intestinal flora , and to study the effects of LGG on sepsis . LGG has a positive regulatory effect on the serum and feces of septic mice . The results suggest that LGG has a positive regulatory effect on the serum and fecal metabolites of septic mice . Conclusion : LGG is closely related to the metabolism of fecal metabolism . LGG is closely related to energy expenditure , inflammatory reaction , oxidative stress , etc . LGG is closely related to the abnormal metabolism of feces . LGG can normalize the serum and fecal metabolism of septic mice by rebalancing the intestinal microecology .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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1 Karen S Allen;Eva Sawheny;Gary T Kinasewitz;;Anticoagulant modulation of inflammation in severe sepsis[J];World Journal of Critical Care Medicine;2015年02期

2 Kajsa Kajander;Eveliina Myllyluoma;Sinikka Kyrnpalo;Martin Rasmussen;Pentti Sipponen;Ismo Mattila;Tuulikki Seppnen-Laakso;Heikki Vapaatalo;Matej Orei;Riitta Korpela;;Elevated pro-inflammatory and lipotoxic mucosal lipids characterise irritable bowel syndrome[J];World Journal of Gastroenterology;2009年48期

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本文編號：1395042