發(fā)布時間：2020-10-23 08:07

　　 目的:探討NRF2信號通路在錳致小鼠睪丸間質細胞(TM3細胞)損傷中的作用及其可能機制,為錳的生殖毒性機制研究和NRF2信號通路在錳致TM3細胞損傷中的生物學功能以及該通路在疾病中的作用和作用機制提供新的實驗依據,為后續(xù)的研究和新藥的開發(fā),以及疾病的治療提供新的思路和途徑。方法:通過細胞培養(yǎng)技術,將細胞分為以下幾組,分別是:1、空白對照組(MnCl_2:0μmol/L,C組),2、低劑量染錳組(MnCl_2:100μmol/L,L組),3、中劑量染錳組(MnCl_2:200μmol/L,M組),4、高劑量染錳組(MnCl_2:300μmol/L,H組),5、激動劑對照組(TBHQ:10μmol/L,TC組),6、激動劑+低劑量組(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,TL組),7、激動劑+中劑量組(TBHQ:10μmol/L+MnCl_2:200μmol/L,TM組),8、激動劑+高劑量組(TBHQ:10μmol/L+Mncl2:300μmol/L,TH組);9、抑制劑對照組(ATRA:10μmol/L,RC組),10、抑制劑+低劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:100μmol/L,RL組),11、抑制劑+中劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:200umol/L,RM組),12、抑制劑+高劑量組(ATRA:10μmol/L+MnCl_2:300μmol/L,RH組);染錳時間均為24小時。用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),MTT法測細胞活力,AnnnexinV/PI雙染色法測凋亡率,DCFH-DA探針測ROS水平,TBA法測細胞內MDA含量,Western Blot及RT-Qpcr技術測細胞內NRF2、HO-1、GSTpi、SOD、NQO1等蛋白和基因的表達。結果:1、MTT實驗發(fā)現在染毒24h、48h和72h三個時間段各劑量組中細胞存活率差異皆有統計學意義(P0.05),且染錳劑量越高,細胞存活率越低。其他各組與對照組相比,隨著染錳劑量增加,TM3細胞存活率逐漸降低,差異有統計學意義(P0.05),且具有劑量-效應關系;加抑制劑前后各劑量組相比,加抑制劑組細胞存活率有所降低,差異均有統計學意義(P0.05);與中高劑量組相比,加激活劑同一劑量組細胞存活率有所增加,差異有統計學意義(P0.05),2、在倒置相差顯微鏡下觀察經不同染錳濃度(0μmol/L,100 umol/l,,200μmol/L,300μmol/L)以及經抑制劑ATRA(10μmol/L)、激活劑TBHQ(10μmol/L)預處理TM3細胞1.5h后再染不同濃度錳后,觀察TM3細胞形態(tài)變化發(fā)現C組和RC組細胞貼壁牢固,胞體飽滿,分化良好,增殖的細胞相互連接成單層網狀,胞質鋪展,伸出突起。隨著染錳劑量的增加,細胞逐漸回縮變圓,細胞漂浮增多,并逐漸產生細胞碎片。經抑制劑ATRA處理再染毒發(fā)現,漂浮細胞更突出,細胞回縮變圓且產生的細胞碎片也增多;C組和激活劑TC組細胞貼壁牢固,分化良好,胞體飽滿,增殖的細胞連接成單層網狀,胞質鋪展,伸出突起,其中TC組細胞狀態(tài)更好。隨著染錳濃度的增加,以上變化更明顯,經激動劑處理再染錳發(fā)現,細胞濃縮變圓及懸浮細胞不明顯,且產生的細胞碎片的量不及未加激動劑組多。3、在雙變量流式散點圖中顯示,與C組相比,其他各組凋亡率升高,差異有統計學意義(P0.05);與未加抑制劑各組相比,加抑制劑同一劑量組凋亡率均升高,差異有統計學意義(P0.05),而加激活劑同一劑量組組凋亡率均降低,差異有統計學意義(P0.05);4、DCFH-DA探針檢測細胞內ROS水平發(fā)現不同濃度錳及預染激活劑TBHQ、抑制劑ATRA再染錳作用于TM3細胞后,與C組相比,加激活劑前后各組細胞中的ROS含量均明顯增高,其中濃度越高,TM3細胞中ROS含量越高;與未加激活劑各組相比,加激活劑各組ROS含量均明顯降低,差異具有統計學意義(P0.05);加抑制劑同一劑量組ROS含量均增高,差異具有統計學意義(P0.05)5、TBA法檢測細胞內MDA水平發(fā)現不同濃度錳及預染激活劑TBHQ、抑制劑ATRA再染錳作用于TM3細胞后,與C組相比,加激活劑前后各組細胞中的MDA含量均明顯增高,且劑量越大,MDA含量越高;與中高劑量組相比,加激活劑同一劑量組MDA含量均明顯降低,差異具有統計學意義(P0.05);與低中劑量組相比,加抑制劑同一劑量組MDA含量均明顯增高,差異具有統計學意義(P0.05)6、Western Blot技術檢測各組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi蛋白的表達量,與低中高劑量組相比,加抑制劑同一劑量組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表達量都下降,差異均有統計學意義(P0.05),與M、H組相比,TM、TH組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi的表達量均有所升高(P0.05),差異有統計學意義(P0.05),與TC組相比,TM、TH組Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等表達量隨染錳濃度增加,其表達量亦逐漸增加,差異有統計學意義(P0.05)。7、利用RT-Qpcr方法測定錳對TM3細胞以及抑制劑、激動劑處理后再染錳對TM3細胞中Nrf2、HO-1、NQO1、SOD、GSTpi等基因mRNA表達的變化,TM3細胞經錳刺激后各組Nrf2mRNA表達量之間的差異均無統計學意義(P0.05);與對照組相比,加激活劑各劑量組HO-1mRNA的表達量均增高,加抑制劑各劑量組HO-1mRNA的表達量有所降低,差異有統計學意義(p0.05);與未加激活劑抑制劑各組相比,加激活劑組組HO-1mRNA的表達量均增加,差異有統計學意義(p0.05),加抑制劑各組HO-1mRNA的表達量均降低,差異有統計學意義(p0.05);NQO1mRNA的表達量只有加抑制劑同一劑量組和低中劑量組相比,加抑制劑各劑量組NQO1mRNA的表達量低于低中劑量組,差異具有統計學意義(p0.05));SODmRNA表達量在加抑制劑各劑量組前后相比,加抑制劑ATRA各劑量組SODmRNA表達量低于未加抑制劑ATRA同一劑量組,差異有統計學意義(p0.05);GSTpimRNA表達量在加激活劑前后相比,加抑制劑后各組GSTpimRNA表達量低于加抑制劑前同一劑量組。差異有統計學意義(p0.05)。加激活劑前后中高劑量組相比,加激活劑后中高劑量組GSTpimRNA表達量高于未加中高劑量組,差異有統計學意義(p0.05)。結論:Nrf2信號通路的激活可能是拮抗錳致TM3細胞氧化損傷的重要機制之一。
【學位單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 朱3 結果3.1 加入激動劑及抑制劑前染錳對 TM3 細胞的影響3.1.1 TM3 細胞生長曲線 數據錄入 graphpad 軟件，繪制細胞生長曲所示，TM3 細胞隨培養(yǎng)時間延長其 OD 值亦逐漸升高，培養(yǎng) 24h 以后進入到長期，60h 以后進入平臺期，所以，本次實驗細胞均選擇培養(yǎng)周期大于 24h 且的細胞進行研究。

MnCl2concentration(umol/L)圖 2 不同時間和濃度 Mn2+對 TM3 細胞活力的影響Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cells.

MnCl2concentration(umol/L)圖 2 不同時間和濃度 Mn2+對 TM3 細胞活力的影響Fig.2 Effect of different time and concentration of Mn2+on the activity of TM3 cel
【參考文獻】

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本文編號：2852765