發(fā)布時間：2020-10-18 16:06

　　 研究目的由鎳引起的職業(yè)性接觸性皮炎(OCD)是一種常見的職業(yè)性皮膚病,也是我國職業(yè)衛(wèi)生領(lǐng)域需要關(guān)注的問題。OCD的發(fā)生會給人們帶來生活和工作上的不便。目前對該病的發(fā)病機(jī)制雖有研究但尚未明確,難以向患者提供有效的預(yù)防和治療措施。本文試圖通過對2種免疫相關(guān)細(xì)胞的共培養(yǎng),探索鎳致OCD過程中細(xì)胞間相互作用的可能機(jī)制。通過檢測HaCaT細(xì)胞活率、THP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平及其表面標(biāo)志物CD54、CD86的表達(dá)情況,以及炎性因子IL-18、IL-1β和IL-8的分泌情況并進(jìn)行分析,為2種鎳化合物致OCD的機(jī)制做初步的探索。研究方法1.鎳化合物對HaCaT細(xì)胞影響:配制不同濃度NiCl_2·6H_2O和NiSO_4·6H_2O溶液,使用MTT法分別檢測2種化合物對體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞的毒性作用。2.鎳化合物對THP-1細(xì)胞的影響:配制不同濃度的NiCl_2·6H_2O和NiSO_4·6H_2O溶液,探討THP-1在細(xì)胞活率大于50%時細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞表面標(biāo)記物(CD54、CD86)變化。3.使用HaCaT細(xì)胞與THP-1細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系,再暴露于不同濃度NiCl_2·6H_2O和NiSO_4·6H_2O溶液,檢測THP-1細(xì)胞在受到鎳刺激后表面標(biāo)志物(CD54、CD86)的表達(dá)情況,同時對培養(yǎng)基中IL-18、IL-1β和IL-8濃度進(jìn)行分析,比較2種細(xì)胞共培養(yǎng)與單細(xì)胞系統(tǒng)的各檢測指標(biāo)是否具有差異性,初步探索鎳致OCD過程中2種細(xì)胞間相互作用的關(guān)系。研究結(jié)果1.在本實(shí)驗(yàn)條件下,2種鎳化合物均能對HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,其中NiCl_2·6H_2O的IC_(50)均值為273.44μg/mL,CV75為113.30μg/mL;NiSO_4·6H_2O的IC_(50)與CV75均值分別為392.71μg/mL與191.65μg/mL,其誘導(dǎo)OCD產(chǎn)生的機(jī)制可能與其對表皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。2.由2種鎳化合物對THP-1細(xì)胞影響的結(jié)果來看,在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi),NiCl_2·6H_2O未能引起THP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86、CD54的上升;NiSO_4·6H_2O也未能引起THP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平改變,但可以使THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86、CD54上升,說明2種鎳化合物致敏機(jī)制均不會引起THP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平改變。NiCl_2·6H_2O引起致敏過程中不會直接作用于THP-1細(xì)胞,而NiSO_4·6H_2O可以直接激活THP-1細(xì)胞,引起細(xì)胞表面標(biāo)志物上升,說明鎳鹽所結(jié)合酸根離子(Cl~—、SO_4~(2-))可能對其致敏機(jī)制存在一定影響。3.在本實(shí)驗(yàn)條件下,使用HaCaT細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在共培養(yǎng)系統(tǒng)下,仍未觀察到NiCl_2·6H_2O對THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86、CD54表達(dá)的影響,而能增強(qiáng)NiSO_4·6H_2O對THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物的影響。比較2種鎳化合物對HaCaT細(xì)胞和THP-1細(xì)胞炎性因子分泌結(jié)果發(fā)現(xiàn),2種鎳化合物在各濃度下均未引起HaCaT細(xì)胞IL-8分泌增加,但能促進(jìn)IL-1β分泌增加且有隨濃度上升而增加趨勢,在濃度為125μg/mL和250μg/mL時能促進(jìn)IL-18分泌增加,而在31.25μg/mL和62.50μg/mL濃度下未觀察影響;均未引起THP-1細(xì)胞分泌IL-18,能促進(jìn)IL-8和IL-1β的分泌,但未見顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系;使用共培養(yǎng)時,在濃度低于125μg/mL時,其對IL-18的影響并不明顯,在250μg/mL能促進(jìn)IL-18分泌增加,但顯著低于HaCaT細(xì)胞組,對IL-8分泌相比THP-1細(xì)胞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而IL-1β分泌量顯著高于兩單細(xì)胞組濃度之和。說明,HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18可能與THP-1細(xì)胞表面受體結(jié)合,使培養(yǎng)基中IL-18濃度降低;2種細(xì)胞間的相互作用能夠促進(jìn)IL-1β的分泌;THP-1細(xì)胞分泌IL-8不受HaCaT細(xì)胞影響。研究結(jié)論本研究通過對HaCaT細(xì)胞與THP-1細(xì)胞的體外培養(yǎng),對2種鎳化合物的致敏機(jī)制進(jìn)行了初步探討。NiCl_2·6H_2O和NiSO_4·6H_2O致OCD的機(jī)制可能與其對HaCaT細(xì)胞損傷有關(guān);與THP-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平無關(guān);其中NiCl_2·6H_2O致OCD可能與THP-1細(xì)胞活化無關(guān),NiSO_4·6H_2O可通過THP-1細(xì)胞活化引起OCD;在OCD發(fā)生過程中,HaCaT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18可能會作用于THP-1細(xì)胞,2種細(xì)胞在共同培養(yǎng)時能促進(jìn)IL-1β分泌增加,THP-1細(xì)胞分泌IL-8可能不受HaCaT細(xì)胞調(diào)控。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R135.7
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)流程圖

圖 2.1 受試物 96 孔板加樣圖1）細(xì)胞鋪板：待 HaCaT 角質(zhì)細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶底 85%時，將細(xì)胞消化下來制成胞懸液，根據(jù)生長曲線結(jié)果確定鋪板細(xì)胞密度，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞密度為 0.9×105/mL，取 100 μL 每孔細(xì)胞懸液接種于 96 孔板孵育 24 h 待暴露。

圖 2.2 HaCaT 細(xì)胞（第 8 代，左圖：40×；右圖 100×）圖 2.2 為 HaCaT 細(xì)胞正常生長狀態(tài)。左圖見細(xì)胞密度適中，大小均勻，過多細(xì)胞碎片和漂浮狀態(tài)，緊密貼于瓶底，偶爾見細(xì)胞聚集，說明細(xì)胞處于期，生長活躍。右圖可觀察細(xì)胞形態(tài)，呈不規(guī)則形，界限清晰，連接緊密，
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2846518