MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為19~23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,經(jīng)過加工后,通過完全配對(duì)或者不完全配對(duì)的方式結(jié)合到相對(duì)應(yīng)的靶基因3’非翻譯區(qū),發(fā)揮了降解靶基因或者抑制靶基因翻譯的作用,從而調(diào)控靶基因的表達(dá),是基因表達(dá)調(diào)控研究領(lǐng)域的一個(gè)重大突破。miRNA作為生物體生長發(fā)育過程中的重要調(diào)控基因,目前對(duì)其研究主要方向是探查mi RNAs與各種重大疾病的發(fā)表機(jī)制、預(yù)后及治療的關(guān)系,例如與生長發(fā)育異常的關(guān)系,與遺傳或免疫疾病的關(guān)系,還有與腫瘤的關(guān)系。子宮頸癌(cervcial carcinoma,CC)是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第二位。中國每年新發(fā)病例達(dá)13.15萬,死亡人數(shù)每年約5.3萬,是危害我國女性生殖健康與生命的重要疾病。宮頸癌的病理類型多種多樣,鱗狀細(xì)胞癌是最常見的,約占總體的85%,腺癌排第二約占10~15%,鱗腺癌3%,目前還發(fā)現(xiàn)一些特殊的病理類型如神經(jīng)內(nèi)分泌癌、小細(xì)胞癌和小圓細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌等,惡性程度較前3種類型高[3]。相同臨床分期的宮頸癌患者的預(yù)后仍有不同差別,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期宮頸癌患者經(jīng)過規(guī)范治療通常預(yù)后很好,五年生存率可達(dá)80~90%,而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相同臨床分期患者五年生存率則下降至40~50%。一旦被診斷宮頸癌,對(duì)患者的家庭,社會(huì)經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生資源的消耗都有較大影響。宮頸疾病的三階梯篩查準(zhǔn)則在宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)中起了重要作用,使得宮頸癌的早期診斷率得以顯著提高。但是在發(fā)展中國家,特別是落后邊境地區(qū),由于保健意識(shí)欠缺及經(jīng)濟(jì)條件落后,導(dǎo)致了診斷宮頸癌時(shí)已是晚期,失去了根治性手術(shù)治療,或根治性放療的時(shí)機(jī)。因此,宮頸癌的早期診斷和治療的研究一直是我國婦科腫瘤學(xué)研究的重點(diǎn)。宮頸癌的治療策略仍是以手術(shù)及放射治療為主,對(duì)放療不敏感、復(fù)發(fā)以及中晚期的患者,則采取輔助性治療或姑息性的化學(xué)藥物治療或者靶向治療。本課題組先前進(jìn)行的研究,通過分析宮頸鱗癌患者的血清及組織標(biāo)本的miRNA表達(dá)譜,篩選出組織及血清樣本中均呈高表達(dá)的miRNA有miR-1246、miR-20a、miR-2392、miR-3147、miR-3162-5p、miR-4484。miR-1246在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌患者的癌組織和血清中都存在趨勢(shì)一致的特異性升高,通過統(tǒng)計(jì)分析miR-1246在血清標(biāo)本中識(shí)別淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的特異度為86.0%,ROC曲線下面積為84.7%。提示miR-1246可能在鱗狀細(xì)胞癌這一病理類型中存在普遍的特異性高表達(dá),可能成為類似SCC這樣的血清標(biāo)記物用于判斷宮頸鱗癌患者的病情。并且通過生物信息學(xué)手段和生物實(shí)驗(yàn)證實(shí),thrombospondin-2(THBS2)基因序列中存在mi R-1246的靶點(diǎn),并證明THBS2是miR-1246的一個(gè)靶基因。THBS2是血小板反應(yīng)蛋白家族中的一員,THBS2具有金屬基質(zhì)轉(zhuǎn)移酶(MMPs)的結(jié)合位點(diǎn),可協(xié)同其他基因調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的水解作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附和遷移力。推測(cè)THBS2可能通過調(diào)節(jié)MMP(基質(zhì)金屬蛋白酶)和ECM(細(xì)胞外基質(zhì)),起到抑制腫瘤血管生成的作用。本研究的主要目的是探討慢病毒介導(dǎo)的miR-1246表達(dá)下調(diào)對(duì)宮頸癌細(xì)胞系SiHa增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的影響以及其對(duì)下游蛋白THBS2/MMPs/ECM的影響,為以miR-1246及其靶基因?yàn)榘悬c(diǎn)的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。并通過分析miR-1246的靶基因THBS2與宮頸癌臨床病例病理特征和預(yù)后的關(guān)系,初步分析THBS2表達(dá)在宮頸癌中的作用,以期為宮頸癌的臨床診斷、治療和隨訪途徑提供更多的思路。第一部分下調(diào)miR-1246表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖力,凋亡率和侵襲力的的影響1、下調(diào)體外培養(yǎng)的宮頸癌SiHa細(xì)胞的miR-1246表達(dá),觀察宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖,凋亡率和侵襲力的改變目的:檢測(cè)下調(diào)miR-1246表達(dá)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲力和凋亡率的能力的影響。方法:構(gòu)建抑制miR-1246表達(dá)的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照質(zhì)粒,包裝慢病毒,感染宮頸癌SiHa細(xì)胞,使該細(xì)胞的miR-1246穩(wěn)定下調(diào)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三組:空白對(duì)照組(SiHa,Blank組)、陰性對(duì)照組(感染了攜帶綠色熒光表達(dá)質(zhì)粒的重組慢病毒,稱LV-NC)與miR-1246表達(dá)下調(diào)組(感染了攜帶miR-1246-Inhibitor表達(dá)質(zhì)粒和綠色熒光的重組慢病毒,稱為LV-miR-1246-Inh),在體外觀察mi R-1246-Inh對(duì)SiHa細(xì)胞增殖及凋亡的影響。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線、CCK8法檢測(cè)增殖抑制率,利用Annexin V/7-ADD雙染色法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布情況。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)比較不同處理組細(xì)胞的侵襲力。結(jié)果:重組慢病毒LV-miR-1246-Inh可有效下調(diào)SiHa細(xì)胞內(nèi)miR-1246的表達(dá)水平。細(xì)胞生長曲線和CCK8檢測(cè)結(jié)果提示,LV-miR-1246-Inh組宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖速度低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,表明miR-1246表達(dá)下調(diào)可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的生長。流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞凋亡率提示,LV-miR-1246-Inh組的宮頸癌細(xì)胞平均凋亡率高于其余兩個(gè)對(duì)照組。流式細(xì)胞周期分析提示,與對(duì)照組相比,miR-1246表達(dá)下調(diào)出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,S期比率增加。這些結(jié)果表明,體外實(shí)驗(yàn)中,miR-1246表達(dá)下調(diào)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,推測(cè)miR-1246在宮頸癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。結(jié)論:miR-1246表達(dá)下調(diào)可抑制人宮頸癌細(xì)胞系SiHa的增殖,阻滯細(xì)胞周期,減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲力。2、miR-1246下調(diào)表達(dá)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的:探討miR-1246表達(dá)下調(diào)對(duì)SiHa細(xì)胞在體內(nèi)腫瘤形成能力的抑制。方法:篩選穩(wěn)定miR-1246表達(dá)下調(diào)的宮頸癌SiHa細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。觀察抑制瘤生長曲線,計(jì)算抑瘤率。結(jié)果:LV-miR-1246-Inh組與對(duì)照組相比,成瘤時(shí)間晚,腫瘤生長緩慢,實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積小于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:miR-1246表達(dá)下調(diào)可抑制移植瘤的生長。第二部分miR-1246對(duì)THBS2/MMPs信號(hào)途徑的影響1、探討miR-1246對(duì)THBS2信號(hào)途徑的作用目的:研究miR-1246影響宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖及侵襲能力的內(nèi)在分子機(jī)制是否通過THBS2信號(hào)途徑調(diào)節(jié)。方法:取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(LV-NC)與miR-1246抑制組(LV-miR-1246-Inh)移植瘤組織,利用實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢測(cè)THBS2及其下游基因MMP2,MMP9和ECM的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.LV-miR-1246-Inh組中,THBS2 mRNA及蛋白表達(dá)水平最高,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;2、內(nèi)源性下調(diào)miR-1246水平后,THBS2相關(guān)基因MMP2、MMP9表達(dá)下降,而ECM表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:通過分析移植瘤組織中THBS2及其相關(guān)基因的表達(dá),提示重組慢病毒LV-miR-1246-Inh可以使得THBS2表達(dá)上調(diào),THBS2表達(dá)上調(diào)同時(shí)其相關(guān)的基因表達(dá)同時(shí)改變。第三部分宮頸癌組織中THBS2的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系目的:研究宮頸癌患者的組織標(biāo)本中THBS2的表達(dá)與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。方法:收集52例新鮮人宮頸癌組織標(biāo)本,利用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)THBS2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,Western Blot檢測(cè)THBS2蛋白表達(dá)水平,分析THBS2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。通過隨訪,分析THBS2表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:宮頸癌組織中的THBS2表達(dá)量低于正常宮頸組織,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),THBS2的低表達(dá)與宮頸癌宮旁浸潤、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。THBS2盡管不是影響宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立因子,但是高表達(dá)者的生存期優(yōu)于低表達(dá)者。結(jié)論:THBS2低表達(dá)提示宮頸癌不良預(yù)后。總結(jié):1.用感染重組慢病毒的方法在宮頸癌細(xì)胞中穩(wěn)定下調(diào)miR-1246的表達(dá)在體內(nèi)外均可以抑制宮頸癌細(xì)胞SiHa生長,抑制其浸潤轉(zhuǎn)移。2.mi R-1246表達(dá)下調(diào)后可以負(fù)調(diào)節(jié)靶基因THBS2表達(dá),使其表達(dá)水平上調(diào),并且導(dǎo)致THBS2下游相關(guān)基因MMP2、MMP9、ECM的表達(dá)改變,從而抑制了宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖能力和侵襲力。3.宮頸癌組織中THBS呈低表達(dá)狀態(tài);THBS2低表達(dá)者生存期較高表達(dá)者短,提示THBS2低表達(dá)與宮頸癌惡性生長及不良預(yù)后有關(guān),有望成為判斷宮頸癌預(yù)后的標(biāo)記物和基因輔助治療的靶點(diǎn)。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.33
【部分圖文】：
毒轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞株 293T 和大腸桿菌 DH．5a由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤驗(yàn)研究部保存；雌性 BaLb／c 裸鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4- 周齡，體重（14 士 2）g，實(shí)驗(yàn)計(jì)劃經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)準(zhǔn)。.4.2 慢病毒包裝系統(tǒng)采用商業(yè)化的質(zhì)粒載體系統(tǒng)，三質(zhì)粒系統(tǒng)，由慢病毒 達(dá) 載 體 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFR-puro 以 及 pHelper1.0 載 體 和Helper2.0 載體這兩種結(jié)構(gòu)、包裝質(zhì)粒組成，表達(dá)載體采用 U6 啟動(dòng)子，含原核生物篩選抗性氨芐青霉素和真核生物篩選抗性（嘌呤霉素），同時(shí)含綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)原件。慢病毒載體包裝、感染細(xì)胞后可穩(wěn)定下調(diào)表達(dá) miR-1246（以下簡稱為 LV-miR-246Inh）。
圖 1-2 轉(zhuǎn)染前 293T 細(xì)胞密度（200 倍）Fig1-2 293T cell before infection提高轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染前 2 h 最好更換為無血清培養(yǎng)基；混合物的預(yù)先混合，在滅菌離心管中加入重組載體質(zhì)Inh，及含對(duì)照序列的質(zhì)粒）20 μg、pHelper 1.0 載體質(zhì)粒0 載體質(zhì)粒 10 μg ，以及相應(yīng)體積吉?jiǎng)P專用轉(zhuǎn)染n2000 混合均勻，總體積約 1ml，在室溫下靜置孵育 15 m染混合物緩慢滴加至 293T 細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕柔晃動(dòng)培過程一定要輕柔且均勻，盡可能地不要將細(xì)胞吹起。放入培養(yǎng) 6~12 小時(shí)。養(yǎng) 6 h 后將含有轉(zhuǎn)染混和物的無血清培養(yǎng)基更換為常規(guī)棄無血清培養(yǎng)基后 PBS 液清洗細(xì)胞表面一次，加入含
圖 1-3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后 293T GFP表達(dá)Fig1-3 GFP showed in 293T cell after transfection慢病毒毒液的收獲及濃縮) 轉(zhuǎn)染 24h 后收集細(xì)胞上清液至離心管，4℃、3000 轉(zhuǎn)離心 10 mi胞碎片；用 0.45 μm 的無菌濾器過濾并收集濾液。培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)的含血清 DMEM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染 72h 后可再一次收集上清液（病)將含有病毒顆粒的上清液約 40ml 轉(zhuǎn)移到超速離心管，于低溫超速, 4℃，25000 rpm，離心 2 h。) 離心結(jié)束后，棄去上清，適當(dāng)干燥，加入病毒保存液，反復(fù)輕柔；經(jīng)充分溶解后，4℃高速離心 10000 rpm、5min，收集上清按要
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本文編號(hào)：
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