發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 03:49

　　 目的:碘是合成甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)的必備原料,TH對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。母體碘缺乏會(huì)造成子代神經(jīng)發(fā)育損害、運(yùn)動(dòng)障礙和認(rèn)知缺陷。目前,在許多國(guó)家(包括一些發(fā)達(dá)國(guó)家),孕哺期的婦女仍然處于輕度碘缺乏的風(fēng)險(xiǎn)之中。輕度碘缺乏是造成母體及胎兒低甲狀腺素血癥的最常見(jiàn)原因。低甲狀腺素血癥是指血清游離甲狀腺素(free thyroxine,FT_4)水平降低,而促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)和游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT_3)的水平?jīng)]有改變。研究表明,對(duì)孕哺期重度碘缺乏的母親補(bǔ)碘是有益的,而對(duì)于輕度碘缺乏者是否應(yīng)該補(bǔ)碘還沒(méi)有確切依據(jù)。一些流行病學(xué)研究顯示,對(duì)母親進(jìn)行補(bǔ)碘可能會(huì)降低子代認(rèn)知和行為發(fā)育損害發(fā)生的危險(xiǎn)性。然而,又有另外一些研究表明,補(bǔ)碘與兒童神經(jīng)發(fā)育的損害相關(guān)。因此,孕哺期輕度碘缺乏的母親是否應(yīng)該補(bǔ)碘仍然存在爭(zhēng)議。碘合成的TH是正常小腦功能所必需的激素。小腦維持機(jī)體平衡,調(diào)控運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。浦肯野細(xì)胞是小腦唯一傳出神經(jīng)元,它的樹(shù)突長(zhǎng)度縮短,分支減少或細(xì)胞器形態(tài)發(fā)生改變將導(dǎo)致動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成度下降,運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能受損。運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性由興奮性突觸后慢電流(slow excitatory postsynaptic current,sEPSC)調(diào)控。sEPSC由浦肯野細(xì)胞中Ⅰ型代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor type1,mGluR1)及其下游一系列蛋白構(gòu)成的信號(hào)通路介導(dǎo)。目前,母體孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘是否影響子代小腦浦肯野細(xì)胞器形態(tài)及樹(shù)突分支復(fù)雜性尚不明確,其對(duì)子代運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能及相關(guān)的mGluR1信號(hào)通路的影響仍亟待回答。因此,本研究通過(guò)給予母鼠碘缺乏飼料和含不同濃度碘化鉀的去離子水,建立輕度碘缺乏及補(bǔ)碘模型。探討孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘是否影響子代小腦浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及樹(shù)突形態(tài),進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。以期從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)方面闡述孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘對(duì)子代小腦發(fā)育及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性的影響及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組。健康2月齡雌性Wistar大鼠60只,按體重隨機(jī)分成對(duì)照組、輕度碘缺乏組、補(bǔ)碘組和重度碘缺乏組。各組均給予碘缺乏地區(qū)糧食所配制的飼料,飲用含不同濃度碘化鉀的去離子水。雌鼠每日總碘攝入量分別為7.0μg/d、3.0μg/d、3.0μg/d和1.5μg/d。大鼠飼養(yǎng)三個(gè)月后,按照雌鼠與雄鼠2:1合籠,從母鼠妊娠(gestational day,GD)0天開(kāi)始至仔鼠出生后(postnatal day,PN)21天,補(bǔ)碘組雌鼠總碘攝入量上調(diào)至7.0μg/d。其它三組飲食飲水情況同前。2、動(dòng)物血清TH和TSH水平測(cè)定。于GD0,對(duì)母鼠尾靜脈采血,并分別于PN14和PN21時(shí)對(duì)仔鼠進(jìn)行心臟采血,離心機(jī)3000 rpm,10 min離心。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測(cè)定血清中FT_4、FT_3和TSH水平。3、母鼠尿碘水平測(cè)定。分別于母鼠GD0、GD13和GD19用代謝籠收集尿液,采用過(guò)硫酸銨消化—砷鈰催化分光光度法測(cè)定尿液中碘含量。4、仔鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。于PN14,對(duì)仔鼠進(jìn)行前肢握力實(shí)驗(yàn),記錄仔鼠掉落地面的時(shí)間。于PN21時(shí)分別進(jìn)行平衡木和旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn),記錄仔鼠通過(guò)平衡木及從旋轉(zhuǎn)桿上掉落所需時(shí)間。5、仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突的形態(tài)學(xué)研究。分別取PN14和PN21仔鼠小腦組織進(jìn)行Golgi-Cox染色后,在顯微鏡下觀(guān)察浦肯野細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)。用ImageJ軟件追蹤小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突軌跡,測(cè)量浦肯野細(xì)胞樹(shù)突總長(zhǎng)度。用Sholl分析方法分析樹(shù)突分支復(fù)雜程度。6、仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞電鏡檢測(cè)。取各組PN14時(shí)仔鼠小腦組織,迅速移入固定液中,經(jīng)脫水、包埋、切片、染色后,采用透射電鏡觀(guān)察小腦浦肯野細(xì)胞核及細(xì)胞器的改變。7、仔鼠小腦運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性相關(guān)蛋白的測(cè)定分析。分別于PN14和PN21時(shí),對(duì)各組仔鼠斷頭取小腦,采用Western Blot方法測(cè)定各組仔鼠小腦Gαq、PLD1、TRPC3和mGluR1的蛋白表達(dá)水平。全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)拍照,用ImageJ軟件測(cè)量各條帶灰度值。8、仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞mGluR1和TRPC3免疫熒光測(cè)定分析。分別取PN14和PN21仔鼠,灌流固定小腦,包埋,制作石蠟切片,觀(guān)察小腦浦肯野細(xì)胞mGluR1和TRPC3的熒光表達(dá)情況。9、統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均使用軟件SPSS17.0進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為mean±SEM。采用單因素方差分析比較各組間差異。當(dāng)數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí),使用SNK法進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)P0.05時(shí),認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1、孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響TH和TSH的表達(dá)。在母鼠GD0、仔鼠PN14和PN21,輕度碘缺乏組與對(duì)照組相比FT_3和TSH水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);補(bǔ)碘組FT_3和TSH水平與對(duì)照組和輕度碘缺乏組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。輕度碘缺乏組各時(shí)間點(diǎn)FT_4水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在GD0,補(bǔ)碘組母鼠FT_4水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與輕度碘缺乏組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在PN14和PN21,補(bǔ)碘組仔鼠與對(duì)照組相比FT_4水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在各時(shí)間點(diǎn),重度碘缺乏組FT_4和FT_3均分別低于對(duì)照組和輕度碘缺乏組,而TSH水平均高于對(duì)照組和輕度碘缺乏組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響尿碘濃度。輕度碘缺乏組母鼠孕早期、孕中期和孕晚期尿碘水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。補(bǔ)碘組母鼠孕早期尿碘水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與輕度碘缺乏組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);孕中期和孕晚期尿碘水平與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但均高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。重度碘缺乏組母鼠各時(shí)期尿碘水平均低于對(duì)照組和輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響仔鼠小腦運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。在PN14前肢握力實(shí)驗(yàn)、PN21旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)中,輕度碘缺乏組仔鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性均比對(duì)照組差,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。補(bǔ)碘組仔鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性與對(duì)照組相比均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但均好于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。重度缺乏組仔鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性分別比對(duì)照組和輕度碘缺乏組差,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突形態(tài)。在PN14和PN21,輕度碘缺乏組仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突總長(zhǎng)度及分支復(fù)雜程度均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。補(bǔ)碘組仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突總長(zhǎng)度與對(duì)照組相比均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),樹(shù)突總長(zhǎng)度及分支復(fù)雜程度均高于輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。重度缺乏組各時(shí)間點(diǎn)仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突總長(zhǎng)度均分別低于對(duì)照組和輕度碘缺乏組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響仔鼠小腦浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。在PN14,輕度碘缺乏組浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微的異常改變,表現(xiàn)為輕微的核膜內(nèi)陷,部分線(xiàn)粒體嵴斷裂甚至消失。補(bǔ)碘組浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞核及細(xì)胞器均未發(fā)生改變。重度碘缺乏組浦肯野細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p害。浦肯野細(xì)胞核皺縮,核膜內(nèi)陷,邊緣呈鋸齒狀;線(xiàn)粒體吞噬異物并且嵴斷裂,光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。6、孕哺期對(duì)輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響仔鼠小腦運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性相關(guān)蛋白表達(dá)。在PN14和PN21,輕度碘缺乏組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組。補(bǔ)碘組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有差異,但均高于輕度碘缺乏組。重度缺乏組仔鼠小腦mGluR1、Gαq、PLD1和TRPC3蛋白表達(dá)水平均分別低于對(duì)照組和輕度碘缺乏組。結(jié)論:1、孕哺期輕度碘缺乏損傷小腦浦肯野細(xì)胞樹(shù)突發(fā)育和超微結(jié)構(gòu)。2、孕哺期輕度碘缺乏可能通過(guò)抑制mGluR1信號(hào)途徑而損害小腦運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。3、妊娠早期補(bǔ)碘可改善由于輕度碘缺乏所造成的小腦浦肯野細(xì)胞受損及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性障礙。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R715.3
【部分圖文】：

圖 3.1 孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘對(duì) TH 和 TSH 水平的影響：母鼠 GD0（n = 6）；仔鼠 PN14（n = 8），PN21（n = 8）。*，與對(duì)照；#，與輕度碘缺乏組相比，P < 0.05。）哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘影響尿碘濃度度碘缺乏組母鼠孕早期、孕中期和孕晚期 UIC 均低于對(duì)照組，差異（P < 0.05）。補(bǔ)碘組母鼠孕早期 UIC 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)，與輕度碘缺乏組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05）；孕中期和對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05），但均高于輕度碘缺乏組學(xué)意義（P < 0.05）。重度碘缺乏組母鼠各時(shí)期 UIC 均低于對(duì)照組組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（表 3.1）。

圖 3.2 孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘對(duì)仔鼠旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)的影響：n = 5-11。*，與對(duì)照組相比，P < 0.05；#，與輕度碘缺乏組相比，P < 圖 3.3 孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘對(duì)仔鼠平衡木實(shí)驗(yàn)的影響

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 3.2 孕哺期輕度碘缺乏及補(bǔ)碘對(duì)仔鼠旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)的影響注：n = 5-11。*，與對(duì)照組相比，P < 0.05；#，與輕度碘缺乏組相比，P <
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